一种酿酒酵母Rim15蛋白突变体及其应用

本发明涉及一种蛋白突变体及其应用，尤其涉及一种酿酒酵母rim15蛋白突变体涉及其在提高酿酒酵母木糖利用效率及乙酸耐受性中应用。属于基因工程。

背景技术：

1、用可再生的木质纤维素材料替代不可再生的化石能源来生产燃料和化学品，是拓展生活资源来源，减少二氧化碳排放和减缓全球变暖进程的一项有前途的战略。生物乙醇是最具有发展前景的液体燃料产品之一，目前有多个国家使用在汽油中混入10-25％的生物乙醇的混合燃料(ali,nasir et al.,2020；dhande,d y et al.,2021)。

2、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是公认的食品级安全微生物(gras)，由于其发酵速率快，糖醇转化率高，鲁棒性强等特点，被认为是最佳的乙醇发酵细胞工厂(jinys,cate jh.,2017)。为了实现以木质纤维素为原料的乙醇生产，尽可能降低成本，通常从两方面对菌株进行改造。首先，木质纤维素水解主要生成葡萄糖和木糖，但是，野生酿酒酵母通常不能代谢木糖。通过代谢工程手段在酿酒酵母中引入木糖代谢途径的重组酿酒酵母具有利用木糖的能力，但是，木糖利用效率远低于葡萄糖利用效率，并且发酵底物中葡萄糖的存在对木糖利用有明显的负面影响(jagtap ss,rao cv.,2018)，因此提高重组菌株在葡萄糖木糖混合发酵中利用木糖的效率成为了本领域迫切需要解决的技术问题。其次，水解液中存在乙酸、糠醛等对酵母生长代谢有抑制作用的化合物(后简称抑制物)(almario,maría p et al.,2013)，这些抑制物会降低甚至阻遏乙醇生产。为此，应尽量赋予发酵菌株在利用葡萄糖的同时高效利用木糖的能力，从而充分利用原料；同时提高菌株对抑制物的耐受性，减少抑制物对生产效率的影响。

3、近年来，已开始有工作根据细胞全局调控理念，从调节某些重要的蛋白激酶着手，提高重组菌株木糖利用效率或者增强菌株对抑制物的耐受性。据报道，酿酒酵母中的rim15是一种参与细胞增殖以响应营养物质的蛋白激酶；参与细胞对营养物质增殖反应的信号转导，特别是静止期的建立。但申请人研究发现敲除蛋白激酶rim15的编码基因rim15能提高酿酒酵母重组菌株木糖利用效率；同时还发现，表达点突变子rim15g82d能实现提高酿酒酵母重组菌株木糖的利用效率同时还能增强其对木质纤维素中主要抑制物乙酸的耐受性。经检索，所述这些研究发现以及rim15在提高木糖利用效率、增强菌株对抑制物耐受性方面的作用还未见报道。

技术实现思路

1、针对目前重组酿酒酵母在葡萄糖木糖共发酵过程中对木糖的利用效率仍需提升，并且对木质纤维素原料耐受性仍需提高的现状，本发明的目的是提供一种酿酒酵母rim15蛋白突变体涉及其在提高酿酒酵母木糖利用效率及乙酸耐受性中应用。

2、本发明所述的酿酒酵母rim15蛋白突变体，其特征在于：所述rim15蛋白突变体命名为rim15g82d，是由氨基酸序列如seq id no.1所示的调控蛋白即酿酒酵母rim15蛋白的第82位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸形成，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明提供了一种表达的rim15蛋白为上述rim15蛋白突变体的重组酿酒酵母。

4、其中：所述重组酿酒酵母优选是酿酒酵母菌株bsgx201-rim15g82d，其细胞中携带编码rim15蛋白突变体rim15g82d的基因rim15g82d，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、本发明所述酿酒酵母rim15蛋白突变体在提高重组酿酒酵母木糖利用效率和/或提高酿酒酵母对乙酸的耐受性中的应用。

6、上述的重组酿酒酵母在提高木糖利用效率和/或提高对乙酸的耐受性中的应用。

7、实验证实：本发明提供的表达rim15的点突变子rim15g82d促进了重组酿酒酵母利用木糖的效率；增强了酿酒酵母的乙酸耐受性。表达上述rim15蛋白突变体的酿酒酵母菌株木糖利用效率相对于出发菌株提高了17.5％；在含有2％乙酸的培养基中延迟期短，生长速率快，最终菌体生物量高。

8、本发明提供了一种酿酒酵母rim15蛋白的缺失突变体在提高重组酿酒酵母对木糖利用效率中的应用，其中所述酿酒酵母rim15蛋白的缺失突变体是其细胞缺失核苷酸序列如seq id no.4所示的编码rim15蛋白的基因rim15，该酿酒酵母rim15蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

9、本发明提供了一种缺失了rim15蛋白表达的重组酿酒酵母，其中所述rim15蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

10、其中：所述重组酿酒酵母是酿酒酵母菌株bsgx201-rim15δ，其细胞中核苷酸序列如seq id no.4所示的编码rim15蛋白的基因rim15被敲除。

11、上述缺失了rim15蛋白表达的重组酿酒酵母在提高木糖利用效率中的应用。

12、实验证实：本发明提供的缺失rim15蛋白的技术方案显著促进了重组酿酒酵母利用木糖的效率。缺失rim15蛋白的重组酿酒酵母菌株木糖利用效率相对于出发菌株提高了49.1％。

13、本发明提供了一种在提高酿酒酵母木糖利用效率的同时提高其对乙酸的耐受性的方法，其特征在于：所述方法是将氨基酸序列如seq id no.1所示的调控蛋白rim15蛋白的第82位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸进而获得表达氨基酸序列如seq id no.2所示的rim15蛋白突变体的重组酿酒酵母实现。

14、综上，实施本发明所述技术方案的实验效果显示：敲除蛋白激酶rim15的编码基因rim15能提高酿酒酵母重组菌株木糖利用效率；进一步的，表达点突变子rim15g82d能实现提高酿酒酵母重组菌株木糖的利用效率同时还能增强其对木质纤维素中主要抑制物乙酸的耐受性。上述实验结果预示本发明在利用同时含有葡萄糖和木糖的，含有乙酸等抑制物的木质纤维素为主的原料发酵生产化工产品如乙醇中具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种酿酒酵母rim15蛋白突变体，其特征在于：所述rim15蛋白突变体命名为rim15g82d，是由氨基酸序列如seq id no.1所示的调控蛋白即酿酒酵母rim15蛋白的第82位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸形成，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.一种表达的rim15蛋白为权利要求1所述rim15蛋白突变体的重组酿酒酵母。

3.根据权利要求2所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述重组酿酒酵母是酿酒酵母菌株bsgx201-rim15g82d，其细胞中携带编码rim15蛋白突变体rim15g82d的基因rim15g82d，其核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.权利要求1所述酿酒酵母rim15蛋白突变体在提高重组酿酒酵母木糖利用效率和/或提高酿酒酵母对乙酸的耐受性中的应用。

5.权利要求2或3所述的重组酿酒酵母在提高木糖利用效率和/或提高对乙酸的耐受性中的应用。

6.一种酿酒酵母rim15蛋白的缺失突变体在提高重组酿酒酵母对木糖利用效率中的应用，其中所述酿酒酵母rim15蛋白的缺失突变体是其细胞缺失核苷酸序列如seq id no.4所示的编码rim15蛋白的基因rim15，该酿酒酵母rim15蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

7.一种缺失了rim15蛋白表达的重组酿酒酵母，其中所述rim15蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。

8.根据权利要求7所述的重组酿酒酵母，其特征在于：所述重组酿酒酵母是酿酒酵母菌株bsgx201-rim15δ，其细胞中核苷酸序列如seq id no.4所示的编码rim15蛋白的基因rim15被敲除。

9.权利要求7或8所述的重组酿酒酵母在提高木糖利用效率中的应用。

10.一种在提高酿酒酵母木糖利用效率的同时提高其对乙酸的耐受性的方法，其特征在于：所述方法是将氨基酸序列如seq id no.1所示的调控蛋白rim15蛋白的第82位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸进而获得表达氨基酸序列如seq id no.2所示的rim15蛋白突变体的重组酿酒酵母实现。

技术总结
本发明公开了一种酿酒酵母Rim15蛋白突变体，是由氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的调控蛋白的第82位氨基酸由甘氨酸突变为天冬氨酸形成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明还公开了该突变体在提高重组酿酒酵母木糖利用效率和/或提高酿酒酵母对乙酸的耐受性中的应用。实验证明通过在酿酒酵母中表达该突变体，大幅提高了其木糖利用效率和乙酸耐受性。本发明还公开了一种Rim15蛋白的缺失突变体，以及Rim15蛋白缺失突变体在提高重组酿酒酵母对木糖利用效率中的应用。实验表明，缺失Rim15蛋白可以大幅提高重组酿酒酵母的木糖利用效率。预示本发明在利用同时含有葡萄糖和木糖的且含有乙酸等抑制物的木质纤维素为主的原料发酵生产化工产品中应用前景广阔。

技术研发人员：沈煜,邱亚丽
受保护的技术使用者：山东大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11