一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物和试剂盒的制作方法

本发明涉及生物，具体涉及一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物和试剂盒。

背景技术：

1、犬瘟热是一种传染性极强的烈性传染病，由犬瘟热病毒(cdv)感染引起，主要危害呼吸系统、消化系统及神经系统，临床以双相热、红疹、结膜炎及中枢神经系统损害为主要特征，因此一种及时有效的诊断技术对该病的防治起到关键作用，目前检测cdv方法主要有病毒分离培养、动物接种试验、血清学诊断方法和rt-pcr等。其中病毒分离和动物试验不同程度的存在诊断周期长、操作繁琐、检出率低等不足，而rt-pcr方法对实验仪器的要求很高，并不适合临床检测，并且扩增时间长，一般需要几个小时，难以在基层尤其是一些偏远地区或条件较差的实验室推广使用。

2、环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新型基因扩增方法，其原理是针对靶基因3'和5'端的6个区域设计3对特异性引物，3种特异引物依靠链置换bstdna聚合酶，使得链置换dna合成不停地自我循环，从而实现快速扩增。反应后可根据扩增副产物焦磷酸镁沉淀形成的浊度或者荧光染料判断扩增情况。此反应先形成哑铃状模板，进入循环扩增阶段，再进行伸长、循环扩增，共3个阶段。与荧光定量pcr相比，检测时间短、操作简便、可目视观察结果，但在动物疫病领域应用的报道还较少，lamp方法的优势除了高特异性和高灵敏度外，操作还十分的简单，对仪器的要求也低，具有高效、快速、便捷的特点，更加适于基层现地进行推广使用。但目前并没有一种能够实现现场高效检测犬瘟热病毒的环介导等温扩增产品。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物和试剂盒。本发明所述引物能够实现犬瘟热病毒的高效环介导等温扩增检测，操作简单、特异性强、产物易检测，灵敏度高，重复性好。

2、本发明提供了一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物，所述引物包括外引物cdv-f3和cdv-b3、内引物cdv-fip和cdv-bip、以及环状引物cdv-lb和cdv-lf；所述cdv-f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cdv-b3的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cdv-fip的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cdv-bip的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述cdv-lb的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述cdv-lf的核苷酸序列如seq id no.6所示。

3、本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的检测犬瘟热病毒的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物、反应液和封闭油。

4、优选的是，所述封闭油包括石蜡油。

5、优选的是，每70μl反应体系包括待测样品2μl、反应液10μl、引物8μl和封闭油50μl。

6、优选的是，所述引物中，cdv-f3的浓度为10μm，cdv-b3的浓度为10μm、cdv-fip的浓度为20μm、cdv-bip的浓度为20μm、cdv-lf的浓度为20μm、cdv-lb的浓度为20μm。

7、本发明提供了一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物。利用本发明引物进行犬瘟热病毒的等温扩增，比现有的qpcr方法可节省30～40min，可以检测低至180拷贝数的目的基因片段，可在65℃下快速检测犬瘟热病毒，灵敏度高，特异性好，重复性好，易于大范围推广应用。

技术特征：

1.一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物，其特征在于，所述引物包括外引物cdv-f3和cdv-b3、内引物cdv-fip和cdv-bip、以及环状引物cdv-lb和cdv-lf；所述cdv-f3的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述cdv-b3的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述cdv-fip的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述cdv-bip的核苷酸序列如seq id no.4所示，所述cdv-lb的核苷酸序列如seq id no.5所示；所述cdv-lf的核苷酸序列如seq id no.6所示。

2.一种基于权利要求1所述引物的检测犬瘟热病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述引物、反应液和封闭油。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭油包括石蜡油。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，每70μl反应体系包括待测样品2μl、反应液10μl、引物8μl和封闭油50μl。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物中，cdv-f3的浓度为10μm，cdv-b3的浓度为10μm、cdv-fip的浓度为20μm、cdv-bip的浓度为20μm、cdv-lf的浓度为20μm、cdv-lb的浓度为20μm。

技术总结
本发明涉及一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物和试剂盒，属于生物技术领域。本发明提供了一种用于检测犬瘟热病毒的等温扩增引物，所述引物包括外引物CDV‑F3和CDV‑B3、内引物CDV‑FIP和CDV‑BIP、以及环状引物CDV‑LB和CDV‑LF。本发明所述引物能够实现犬瘟热病毒的高效环介导等温扩增检测，操作简单、特异性强、灵敏度较高，重复性好。

技术研发人员：武小琰,刘佳铤,潜奕青,余飞
受保护的技术使用者：杭州百裕生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15