本发明属于血液制品，涉及一种nk细胞的制备方法。
背景技术：
1、nk细胞是具有自然杀伤功能的天然免疫效应细胞，主要在骨髓微环境中分化、发育，分布于骨髓、外周血、肝脏、脾脏、肺脏和淋巴结。nk细胞不需要特异性抗原刺激，可通过表面受体对“自身”及“非己”进行识别，直接杀伤肿瘤细胞和被病毒感染的靶细胞，是机体对抗病原体和肿瘤细胞的第一道防线。
2、目前，现有方法，诱导的nk细胞数量、纯度及活性均不能满足临床应用需求，其制备过程具有较大的改进空间，因此，本发明提供一种nk细胞的制备方法，解决以上问题。
技术实现思路
1、鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种nk细胞的制备方法，采用的技术方案是，包括以下步骤：
2、步骤一：细胞活化瓶预处理一天，用移液管取20mldpbs加入到60ml的离心管中，取nk试剂a加入dpbs中，拧紧瓶盖上下缓慢颠倒，使a因子充分溶解，将含有a因子的dpbs缓慢加入到200cm2的培养瓶中，拧紧瓶盖，水平放置于台面，记为包被瓶；
3、步骤二：将50～100ml的血样，用移液管将血样转移到离心管中，取出5ml的血样进行检菌，室温下，对全血进行离心处理20分钟1800转/min升9降7，离心结束后，用移液管将上层血浆转入离心管，用封口膜封住瓶口避免污染，进行灭活处理；
4、步骤三：将步骤二离心后的血浆细胞沉淀，用等体积的生理盐水重悬混匀，将混匀的血细胞缓慢地加到淋巴细胞分离液(ficoll层)上，确保分层清晰；
5、步骤四：用移液管弃去步骤三中的上清液，吸取中层(白膜层)，尽量吸尽两液面交接处的细胞层，将该白膜层放入新的离心管中用生理盐水重悬混匀定容至120ml，此时的悬液即为脐血或者外周血单个核细胞；
6、步骤五：将步骤四中的细胞悬液，再次进行离心操作，离心结束后，弃上清，再次清洗细胞沉淀两遍，用手将离心后的细胞沉淀弹散防止其成团，用生理盐水混匀，混匀过程中吸取少量计数；
7、步骤六：从冰箱取出步骤一所述的包被瓶，室温放置5-10分钟，配置活化培养基，培养基在使用前需置于室温置于1h；
8、步骤七：将步骤六的包被瓶加入步骤五的离心细胞液，将其混合液的浓度调整为1-2×106/ml浓度，并加入体积分数为3-10％的自体或异体血浆，进行nk细胞诱导培养3天；
9、步骤八：3天后，将步骤七的原有培养基进行去除，之后进行补液；
10、步骤九：此后，每间隔2-3天对步骤八的包被瓶，添加体积分数为所述活化培养基2-3倍的自体或异体血浆，保证细胞浓度为0.6-2×106/ml，进行nk细胞诱导扩增；
11、步骤十：培养15天，收取细胞，进行计数和检测。
12、作为本发明的一种优选方案，所述步骤一中，在进行包被操作时，需要将水平放置的培养瓶，前后左右晃动1-2min，使包被液充分在瓶底分散覆盖，用封口膜封住瓶口，避免污染，放入冰箱4℃冷藏10-12h。
13、作为本发明的一种优选方案，所述步骤二的血样采用人体外周血或者脐血作为来源，人体外周血为新鲜抽取的血液样本，采样时间在24h以内，脐血为液氮保存时间5-10年的冻存脐带血。
14、作为本发明的一种优选方案，所述步骤二中的灭火处理过程为，将血浆放入水浴锅56℃灭活半小时，将灭活后的血浆置于4℃的冰箱内，冷却静置0.5h。
15、作为本发明的一种优选方案，所述步骤六的活化培养基采用nk细胞基础培养基。
16、作为本发明的一种优选方案，所述步骤五中，离心操作条件为，室温下，外周血作为血浆样本，采用离心处理4-5分钟1500转/min升9降8，脐血作为血浆样本，离心处理8-9分钟1800转/min升9降6。
17、作为本发明的一种优选方案，所述步骤八至步骤十，培养瓶均置于培养箱中37℃，5％co2培养。
18、作为本发明的一种优选方案，所述步骤八至步骤十，从培养箱中取出细胞培养瓶时，应采用水平托盘水平缓移出，避免用手直接操作。
19、本发明的有益效果：采用自体外周血或者脐血细胞中分离得到的单个核细胞，经体外操作使nk细胞活化扩增，通过激活体内特异性免疫反应达到杀灭肿瘤细胞目的，采用纯因子法培养nk细胞，操作流程简便，不含滋养细胞，有效提升nk细胞制备的纯度和活性，技术成本低，可以进行大规模临床应用。
1.一种nk细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，在进行包被操作时，需要将水平放置的培养瓶，前后左右晃动1-2min，使包被液充分在瓶底分散覆盖，用封口膜封住瓶口，避免污染，放入冰箱4℃冷藏10-12h。
3.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤二的血样采用人体外周血或者脐血作为来源，人体外周血为新鲜抽取的血液样本，采样时间在24h以内，脐血为液氮保存时间5-10年的冻存脐带血。
4.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤二中的灭火处理过程为，将血浆放入水浴锅56℃灭活半小时，将灭活后的血浆置于4℃的冰箱内，冷却静置0.5h。
5.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤六的活化培养基采用nk细胞基础培养基。
6.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤五中，离心操作条件为，室温下，外周血作为血浆样本，采用离心处理4-5分钟1500转/min升9降8，脐血作为血浆样本，离心处理8-9分钟1800转/min升9降6。
7.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤八至步骤十，培养瓶均置于培养箱中37℃，5％co2培养。
8.根据权利要求1所述的一种nk细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤八至步骤十，从培养箱中取出细胞培养瓶时，应采用水平托盘水平缓移出，避免用手直接操作。