枯草芽孢杆菌及其在制备预防大口黑鲈虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用

本发明属于饲料，具体涉及一种枯草芽孢杆菌及其在制备预防大口黑鲈虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用。

背景技术：

1、大口黑鲈(largemouth bass,micropterus salmoides)，俗称加州鲈，隶属于鲈形目(perciformes)、鲈亚目(porcoidei)、太阳鱼科(cehtrachidae)、黑鲈属(micropterus)。大口黑鲈源于北美洲，其适应性强、易起捕、养殖周期短、生长快，深受养殖和消费者的欢迎，我国台湾省于上世纪70年代末从国外引进大口黑鲈并于1983年人工繁殖成功，同年大口黑鲈从台湾省引进广东省，如今已推广至全国各地。随着大口黑鲈养殖密度的不断加大，水产病害问题也越发严重。其中大口黑鲈虹彩病毒(largemouth bass ranavirus，lmbv)给大口黑鲈的养殖带来了严重的经济损失，该病毒是大口黑鲈的重要致病病原，其极易感染大口黑鲈，且流行广泛，致使苗期大口黑鲈成活率低，成鱼养殖在高温期容易爆发该虹彩病毒病。目前水产养殖疾病的防控主要依赖于抗生素，而抗生素对病毒病基本没有效果，且抗生素滥用已经导致细菌耐药性、药物残留和环境中扩散等问题。

2、整体上，大口黑鲈的抗病力表现出严重不足，且相关的防治措施甚少。一方面需要在营养上得到保证，保证鱼体健康的营养状态，另一方面，需要提高鱼体自身的免疫能力。在优化目前抗生素滥用带来的恶劣的养殖环境的同时，实现未病先防。因此开发一种能提高鱼体免疫能力的饲料添加剂，在操作上不仅简单、方便，且适用性广，成本低。

技术实现思路

1、针对大口黑鲈所存在的病害问题，本发明提供一种预防大口黑鲈虹彩病毒感染的枯草芽孢杆菌(重组芽孢)，该饲料添加剂属于一种益生菌，在添加到饲料中投喂后不仅能定植于鱼体胃肠道，促进胃肠道的消化且排异病原菌的定植，提高非特异性免疫力，还能提高大口黑鲈的特异性免疫力，针对性的预防大口黑鲈虹彩病毒的感染，本发明同时提供枯草芽孢杆菌在制备预防大口黑鲈预防虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明的预防大口黑鲈虹彩病毒感染的枯草芽孢杆菌的芽孢，是首先克隆出大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白编码基因mcp，将该基因构建于枯草芽孢杆菌表达载体peb03-cotc中，连接于cotc基因片段下游，获得重组表达质粒peb03-cotc-mcp，然后将重组表达质粒peb03-cotc-mcp转化入枯草芽孢杆菌，然后通过诱导表达，即可获得在芽孢表面展示大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp的芽孢，所述的主要衣壳蛋白编码基因mcp的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、优选，所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其制备方法为：

5、(1)以大口黑鲈虹彩病毒基因组dna为模板，以lmbv-f和lmbv-r克隆获得大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白编码基因mcp；

6、引物序列如下：

7、lmbv-f：5`-cataaaaaacactacaagcttatgtcttctgttacgggttctgg-3`；

8、lmbv-r：5`-agtggcaaagtgctagagctcttacaggatggggaaaccca-3`。

9、(2)将基因mcp与经过相同限制性内切酶切割的质粒peb03-cotc以无缝克隆技术进行连接，获得重组质粒peb03-cotc-mcp；

10、(3)将构建好的重组质粒转化入枯草芽孢杆菌感受态细胞，经筛选获得阳性重组枯草芽孢杆菌；

11、(4)将重组枯草芽孢杆菌诱导形成芽孢,使芽孢表面展示目的蛋白mcp。

12、优选，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌wb600。

13、优选，所述的经筛选获得阳性重组枯草芽孢杆菌是经过抗性平板筛选、菌落pcr验证获得阳性重组枯草芽孢杆菌。

14、优选，所述的将重组枯草芽孢杆菌诱导形成芽孢是将重组枯草芽孢杆菌诱导形成芽孢，对芽孢进行纯化回收，获得芽孢悬液。

15、优选，所述的诱导形成芽孢基于耗竭法采用dsm培养基进行诱导，对芽孢进行纯化回收，获得芽孢悬液，所述的dsm培养基配方，按质量分数计：0.8％营养肉汤(difco)，0.1％kcl，0.025％mgso4·7h2o，1.0mm ca(no3)2，10μm mncl2，1.0μm feso4，最佳产孢条件为37℃。

16、本发明的第二个方面，提供了上述枯草芽孢杆菌的芽孢在制备预防大口黑鲈预防虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用。

17、优选，是将枯草芽孢杆菌的芽孢制成芽孢悬液，再将芽孢悬液与饲料按照1×108cfu/g至1×1011cfu/g的比例，均匀地喷洒于饲料表面；将喷洒均匀的饲料放置于阴凉处晾干或低温干燥，即可投入使用。

18、本发明的抗病饲料添加剂，对大口黑鲈遭受大口黑鲈虹彩病毒的入侵具有预防保护的作用。通过以上方式制备获得大口黑鲈抗病饲料，对大口黑鲈分三次隔周投喂该抗病饲料，每次连续投喂7天，间隔7天，42天后，对大口黑鲈注射大口黑鲈虹彩病毒，观察、统计大口黑鲈的死亡情况，并计算该抗病饲料的保护效果。结果表明，该抗病饲料能显著提升大口黑鲈的存活率，相对保护率为45％。

19、本发明的有益效果是：

20、1.本发明以枯草芽孢杆菌芽孢作为载体，制备抗病饲料添加剂。由于芽孢极强的抗逆性，使得重组芽孢能够抵御动物体内极端的胃肠道环境，能够维持所展示的大口黑鲈虹彩病毒主衣壳蛋白的稳定，从而有效刺激鱼体黏膜免疫。

21、2.枯草芽孢杆菌为一种益生菌，重组芽孢可定植于胃肠道，在肠道萌发后形成菌体。并且枯草芽孢杆菌还具有很强的抑菌能力，能够排斥病原菌的入侵和定植，从而提高动物体抵御病原微生物的能力，并提高鱼体非特异性免疫力。

22、3.本发明制备获得的抗病饲料添加剂，通过喷洒于饲料表面获得抗病饲料，投喂大口黑鲈后，能够预防大口黑鲈虹彩病毒的感染，达到对大口黑鲈的免疫保护作用，其相对保护率达到45％，操作简单，普及性和适用性强。

技术特征：

1.一种预防大口黑鲈虹彩病毒感染的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，是首先克隆出大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白编码基因mcp，将该基因构建于枯草芽孢杆菌表达载体peb03-cotc中，连接于cotc基因片段下游，获得重组表达质粒peb03-cotc-mcp，然后将重组表达质粒peb03-cotc-mcp转化入枯草芽孢杆菌，然后通过诱导表达，即可获得在芽孢表面展示大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白mcp的芽孢，所述的主要衣壳蛋白编码基因mcp的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其制备方法为：

3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌wb600。

4.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，所述的经筛选获得阳性重组枯草芽孢杆菌是经过抗性平板筛选、菌落pcr验证获得阳性重组枯草芽孢杆菌。

5.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，所述的将重组枯草芽孢杆菌诱导形成芽孢是将重组枯草芽孢杆菌诱导形成芽孢，对芽孢进行纯化回收，获得芽孢悬液。

6.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌的芽孢，其特征在于，所述的诱导形成芽孢基于耗竭法采用dsm培养基进行诱导，对芽孢进行纯化回收，获得芽孢悬液，所述的dsm培养基配方：0.8％营养肉汤(difco)，0.1％kcl，0.025％mgso4·7h2o，1.0mm ca(no3)2，10μm mncl2，1.0μm feso4，最佳产孢条件为37℃。

7.权利要求1、2、3、4、5或6所述的枯草芽孢杆菌的芽孢在制备预防大口黑鲈预防虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，是将枯草芽孢杆菌的芽孢制成芽孢悬液，再将芽孢悬液与饲料按照1×108cfu/g至1×1011cfu/g的比例，均匀地喷洒于饲料表面；将喷洒均匀的饲料放置于阴凉处晾干或低温干燥，即可投入使用。

技术总结
本发明公开了枯草芽孢杆菌及其在制备预防大口黑鲈虹彩病毒感染的饲料添加剂中的应用。首先克隆出大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白编码基因MCP，将该基因构建于枯草芽孢杆菌表达载体pEB03‑CotC中，连接于CotC基因片段下游，获得重组表达质粒pEB03‑CotC‑MCP，然后将重组表达质粒pEB03‑CotC‑MCP转化入枯草芽孢杆菌，然后通过诱导表达，即可获得在芽孢表面展示大口黑鲈虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP的芽孢。本发明制备获得的抗病饲料添加剂，通过喷洒于饲料表面获得抗病饲料，投喂大口黑鲈后，能够预防大口黑鲈虹彩病毒的感染，达到对大口黑鲈的免疫保护作用，其相对保护率达到45％，操作简单，普及性和适用性强。

技术研发人员：周胜,王权,梁霞,宁运尚,刘士佳,梁增健,陈应静,梁浚嘉,张泽妙,黄艳,黄友华,秦启伟
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13