一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用的制作方法

本发明属于生物工程，涉及一种哺乳动物通用的rna内参基因及其引物和应用，尤其涉及一种可应用于动物病原体rna pcr检测的哺乳动物通用内参基因及引物探针，对多种哺乳动物、多种组织通用，不受基因组dna的干扰。

背景技术：

1、动物病毒的感染不仅对农业生产造成重大影响，许多人畜共患病毒也危害到人类的健康。为了防治病毒性疾病，pcr技术广泛地应用在了动物疫病检测领域，而为了提高pcr的检测质量，有必要引入内参基因检测。

2、由于rna稳定性远低于dna，而相关诊断实验涉及流程多，包括临床样本采集、样本保存运输、rna提取、rt-qpcr反应，其中任何一步操作失误导致rna被降解或者抑制物过多使得扩增反应失败，都可导致实验假阴性。若进行内源性内参基因的检测，在rt-qpcr诊断病原的同时检测样本中内源基因的mrna，可有效对临床样本采集、样本保存运输、rna提取、rt-qpcr反应等全实验过程进行质控，排除实验操作失误、试剂故障、反应失败，一定程度上可规避假阴性，提升诊断结果的可靠度。

3、不少rna病毒都能以多种哺乳动物充当宿主，例如戊型肝炎病毒、流感病毒、口蹄疫病毒、汉坦病毒等。因此进行动物rna病毒pcr监测时可能需要从多种动物样本进行检测，能适用于多种哺乳动物的内参引物具有较强的实用价值。

4、对dna病毒进行pcr检测时设计哺乳动物通用内参引物是易于实现的，例如公认的18s rna的基因在多个物种内高度保守，可以选择合适的区域设计多种动物的通用dna内参基因引物，但这些基因不适合用于rna的内参，因为其基因不含大片段内含子因而无法避开基因组dna的干扰。

5、通常的rna内参技术往往仅适用于人或某一种动物，例如专利《一种甲型、乙型流感病毒核酸检测试剂盒及使用方法》(cn 113789411b)中使用β-actin作为内参基因，对人类基因可以扩增，对其他哺乳动物则不一定适用。

6、此外国内常采用的内参质控方式是，在样品运输到实验室后，在核酸提取之前或在rt-qpcr之前加入外源基因或含外源基因的假病毒，该方法并不能有效监控到上游样本采集和运输保藏过程，且增加额外的实验操作步骤和物料成本。本发明采用内源内参基因检测，避免了这一缺点。

技术实现思路

1、本发明的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种哺乳动物通用的rna内参基因及其引物和应用。该应用于哺乳动物病原体rna pcr检测的通用内参基因，即ppip5k2基因，以及检测ppip5k2基因的人工合成的引物探针序列，其上游引物为cattggctttcacatccagt，下游引物为accttttaacagcagaaccg，探针为cttgtggaacagaagcagaatcctactg。该引物探针可以作为多种动物病原体rna pcr检测试剂盒的组分，用于哺乳动物内参基因的检测。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、第一方面，本发明涉及一种用于动物病原体rna 核酸扩增检测的哺乳动物通用内参基因，所述内参基因为ppip5k2基因。

4、第二方面，本发明涉及一种用于检测ppip5k2内参基因的引物，上游引物为cattggctttcacatccagt，下游引物为accttttaacagcagaaccg。

5、第三方面，本发明涉及一种用于检测ppip5k2内参基因的探针，探针为cttgtggaacagaagcagaatcctactg。

6、第四方面，本发明涉及一种用于检测ppip5k2内参基因在制备动物病原体rna核酸扩增检测产品中的应用，所述产品中包括用于检测所述内参基因的引物和探针。

7、第五方面，本发明涉及一种用于哺乳动物病原体rna 核酸扩增检测的试剂盒，包括用于检测ppip5k2内参基因的引物和探针；上游引物为cattggctttcacatccagt，下游引物为accttttaacagcagaaccg；探针为cttgtggaacagaagcagaatcctactg。

8、作为本发明的一个实施方案，所述核酸扩增检测包括反转录-实时荧光定量pcr检测、反转录-普通pcr检测、反转录-环介导等温扩增检测、反转录-依赖核酸序列的扩增检测、反转录-滚环扩增检测、反转录-单引物等温扩增检测、反转录-依赖解旋酶dna等温扩增、反转录-重组酶聚合酶扩增、反转录-链替代扩增中的任一种。

9、作为本发明的一个实施方案，所述哺乳动物包括但不限于人、猪、鼠、牛、羊、猫、狗。

10、作为本发明的一个实施方案，所述哺乳动物病原体包括但不限于口蹄疫病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒、汉坦病毒。

11、作为本发明的一个实施方案，所述试剂盒用于扩增哺乳动物不同组织提取rna。

12、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

13、1)本发明首次提出在哺乳动物rna病毒pcr检测中建立通用的内参基因。

14、2)本发明首次提出将动物的ppip5k2基因作为内参基因用于哺乳动物病原体rna的rt-pcr检测。

15、3)本发明提出的检测引物，克服了针对普通的内参基因引物仅能适应一种动物的缺陷，使得应用本引物的试剂盒可适用于多种动物内参的检测，大大提高了样本适用范围，提升了检测效率。

技术特征：

1.一种用于动物病原体rna核酸扩增检测的哺乳动物通用内参基因，所述内参基因为ppip5k2基因。

2.一种用于检测权利要求1所述的ppip5k2内参基因的引物，其特征在于，上游引物为cattggctttcacatccagt，下游引物为accttttaacagcagaaccg。

3.一种用于检测权利要求1所述的内参基因的探针，其特征在于，探针为cttgtggaacagaagcagaatcctactg。

4.一种用于检测权利要求1所述的内参基因在制备动物病原体rna核酸扩增检测产品中的应用，所述产品中包括用于检测所述内参基因的引物和探针。

5.一种用于哺乳动物病原体rna核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，包括用于检测权利要求1所述的内参基因的引物和探针；上游引物为cattggctttcacatccagt，下游引物为accttttaacagcagaaccg；探针为cttgtggaacagaagcagaatcctactg。

6.根据权利要求5所述的用于哺乳动物病原体rna核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增检测包括反转录-实时荧光定量pcr检测、反转录-普通pcr检测、反转录-环介导等温扩增检测、反转录-依赖核酸序列的扩增检测、反转录-滚环扩增检测、反转录-单引物等温扩增检测、反转录-依赖解旋酶dna等温扩增、反转录-重组酶聚合酶扩增、反转录-链替代扩增中的任一种。

7.根据权利要求5所述的用于哺乳动物病原体rna核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，所述哺乳动物包括但不限于人、猪、鼠、牛、羊、猫、狗。

8.根据权利要求5所述的用于哺乳动物病原体rna核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，所述哺乳动物病原体包括但不限于口蹄疫病毒、戊型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒、汉坦病毒。

9.根据权利要求5所述的用于哺乳动物病原体rna核酸扩增检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于扩增哺乳动物不同组织提取rna。

技术总结
本发明公开了一种哺乳动物通用的RNA内参基因及其引物和应用；所述内参基因为PPIP5K2基因；上游引物为CATTGGCTTTCACATCCAGT，下游引物为ACCTTTTAACAGCAGAACCG；探针为CTTGTGGAACAGAAGCAGAATCCTACTG。本发明首次提出在哺乳动物RNA病毒PCR检测中建立通用的内参基因；首次提出将动物的PPIP5K2基因作为内参基因用于哺乳动物RNA病毒的RT‑PCR检测；本发明提供的检测引物，克服了针对普通的内参基因引物仅能适应一种动物的缺陷，对多种哺乳动物、多种组织通用，不受基因组DNA的干扰，大大提高了检测效率。

技术研发人员：陈诚,张震,仲从浩,王科,焦文龙,殷波,丁举静,林烨,范可心
受保护的技术使用者：申联生物医药（上海）股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13