一种甲基化内参基因及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术及疾病检测领域，具体而言，涉及一种甲基化内参基因及其应用。

背景技术：

1、甲基化(methylation)是人基因组dna常见的一种表观遗传修饰，是指在dna甲基化转移酶的作用下，将甲基(-ch3)转移到dna胞嘧啶碱基c的第5号碳原子上。dna甲基化参与细胞分化、基因组稳定性、x染色体失活和基因印记等多种细胞生物学过程。在哺乳动物体内常见的甲基转移酶有dnmt3a、dnmt3b和dnmt1，其中dnmt3a和dnmt3b实现dna的从头甲基化(de novo methylation)，而dnmt1负责复制dna模板序列的甲基化模式。

2、dna的甲基化主要发生cpg二核苷酸的碱基c上。约70％的人类基因上游的启动子区上有多个密集的cpg二核苷酸，形成cpg岛(cpg island)。cpg岛的甲基化导致基因表达沉默。除了基因启动子区cpg岛的甲基化，基因的第一号外显子与启动子区类似，也存在甲基化，而导致基因表达的沉默。基因的dna甲基化在肿瘤发生发展中亦发挥重要作用。抑癌基因启动子区的高甲基化抑制基因的表达，使抑癌基因功能丧失，导致肿瘤细胞的增殖失控和侵袭转移，最终导致癌症的发生发展。

3、有研究表明，甲基化修饰发生于肿瘤早期，早于基因突变的发生。cpg二核苷酸的甲基化常常成簇出现，呈连锁状态。因此，dna甲基化比碱基突变、cfdna分子片段特征等的检测更灵敏、更稳定，非常适合肿瘤的早筛、早诊。另外，由于cpg岛与控制基因的表达相关，cpg岛的甲基化可呈现出组织特异性模式，因此，可以用dna甲基化进行癌症的组织溯源。基于以上特征，甲基化是癌症早筛、早诊极为理想的生物标志物。

4、目前，dna甲基化的检测方法可分为化学转化法、酶转化法、酶切法和甲基化dna免疫沉淀法。化学转化法即通过重亚硫酸氢盐将5甲基化胞嘧啶(5-mc)转化成尿嘧啶u，然后进行pcr检测或测序，此类方法有wgbs(whole-genome bisulfite sequencing)、bsas(bisulfite amplicon sequencing)、msp(methylation specific pcr)、bsp(bisulfitesequencing pcr)、qmsp(quantitative methylation specific pcr)。酶转化法即通过tet酶将5-mc转化为5-cac，再用apobec酶将5-cac转化为尿嘧啶u或者通过吡啶硼烷将5-cac转化为dhu，如neb公司的nebnext enzymatic methyl-seq kit和base genomics公司的taps方法。酶切法即通过甲基化敏感或不敏感的内切酶切割甲基化或非甲基化位点，通过pcr或测序进行dna模板的选择性分析，如简化基因组重亚硫酸盐测序rrbs。甲基化dna免疫沉淀法methylated dna immunoprecipitation(medip)，通过抗5-mc的抗体分离出甲基化的dna片段，然后进行相关检测分析。酶转化法对dna的损伤小，转化后的dna回收率高，片段较为完整，但转化效率不稳定。酶切法对dna的损伤小，酶切效率高，但需要对一种或一类dna序列寻找特异性的内切酶，不具有普适性。甲基化dna免疫沉淀法的捕获效率受体系影响较大。重亚硫酸氢盐转化虽然对dna的损伤大，转化后的dna呈片段化，转化回收率低，但转化效率高，转化率稳定，可以识别单碱基甲基化，是dna甲基化检测的金标准，在科研与临床上广泛应用。

5、基于重亚硫酸氢盐转化的荧光定量pcr具有灵敏度高、特异性高、检测体系封闭，不易被污染、技术成熟、成本低等优势广泛用于癌症的早筛、早诊。甲基化特异性荧光定量pcr(quantitative methylation specific pcr，qmsp)在进行靶基因甲基化含量检测时，需要以内参基因作为对照来计算甲基化的相对含量，进行归一化处理，同时减少系统误差，并以内参基因扩增的ct值大小作为判断样本合格的标准。当内参基因的ct值超过某一阈值，认为样本含量过低，判断为样本失不合格，无法进行分析。用靶基因扩增的ct值减去内参基因的ct值，计算△ct值，根据癌症与对照人群的△ct值大小或进一步建模来判断受检者是否患有某种癌症。

6、内参基因一般选择人基因组上的管家基因(housekeeping gene)，其在不同的条件下均稳定表达，如actb、b2m、gapdh、18s rrna等。actb、b2m、gapdh常作为基因突变、拷贝数变异检测的内参基因。但用actb、b2m、gapdh作为基因甲基化检测的内参基因时，存在不足：(1)当dna模板含量较低时，经重亚硫酸氢盐转化后，有效的dna模板含量会更低，出现内参基因不扩增，样本被判断为不合格，无法进行分析；(2)现有内参基因不能准确反映dna样本的起始量与靶基因的甲基化含量，导致计算的靶基因△ct值并不准确。

7、因此，有必要挖掘一种新的内参基因，能适用于基于重亚硫酸氢盐转化的靶基因甲基化含量检测，且能准确地反映dna模板起始量与靶基因的甲基化含量。

8、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种甲基化内参基因及其应用。

2、本发明是这样实现的：

3、第一方面，本发明实施例提供了一种甲基化内参基因，所述内参基因包括：目的序列的全长序列和/或基因片段；所述目的序列包括：sdf4基因5`端上游的启动子区、sdf4基因的外显子区与内含子区及基因3`下游调控区。

4、第二方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其有效组分包括：检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂。

5、第三方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备靶基因的甲基化检测的内参基因的检测试剂中的应用。

6、第四方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，所述用途包括：(1)检测或辅助检测靶基因的甲基化相对含量；(2)预测或辅助预测由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病的风险；(3)诊断或辅助诊断由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病。

7、第五方面，本发明实施例提供了检测前述实施例所述的甲基化内参基因的试剂在靶基因的甲基化检测中的应用。

8、本发明具有以下有益效果：

9、本发明提供一种新的内参基因，该内参基因具有较高的gc含量；且在人的不同疾病、不同组织和不同样本类型的dna中cpg二核苷酸的c高度甲基化且甲基化水平无明显差；与靶基因共同扩增时的扩增效率优于现有常见的内参基因，能更加准确的反映dna模板起始量与靶基因的甲基化含量；可应用于基于甲基化特异性pcr检测的癌症早筛、早诊、术后风险动态监测和辅助判断疾病进程等领域。

技术特征：

1.一种甲基化内参基因，其特征在于，所述内参基因包括：目的序列的全长序列和/或基因片段；所述目的序列包括：sdf4基因5`端上游的启动子区、sdf4基因的外显子区与内含子区及基因3`下游调控区。

2.根据权利要求1所述的甲基化内参基因，其特征在于，所述全长序列和/或所述基因片段的gc含量为40％～80％；

3.根据权利要求1或2所述的甲基化内参基因，其特征在于，所述sdf4基因位于基因组版本号hg19的1号染色体的第1,152,288～1,163,580位碱基与1号染色体的第1,163,740-1,167,447；

4.一种试剂盒，其特征在于，其有效组分包括：检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，其包括：引物探针组合1～引物探针组合7中的任意一种；

6.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在制备靶基因的甲基化检测的内参基因的检测试剂中的应用。

7.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在制备具有以下至少一种用途的产品中的应用，其特征在于，所述用途包括：(1)检测或辅助检测靶基因的甲基化相对含量；(2)预测或辅助预测由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病的风险；(3)诊断或辅助诊断由靶基因的甲基化所引发、导致或关联的相关疾病。

8.检测权利要求1～3任一项所述的甲基化内参基因的试剂在靶基因的甲基化检测中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用不以疾病的诊断或治疗为直接目的。

10.根据权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述甲基化检测的样本包括：dna样本或含dna的环境样本；

技术总结
本发明公开了一种甲基化内参基因及其应用，涉及生物技术及疾病检测领域。本发明提供一种新的内参基因SDF4，该内参基因具有较高GC含量；且在人的不同疾病、不同组织和不同样本类型的DNA中CpG二核苷酸的C高度甲基化且甲基化水平无明显差异；与靶基因共同扩增时的扩增效率优于现有常见的内参基因，能更加准确地反映DNA模板起始量与靶基因的甲基化含量；可应用于基于甲基化特异性PCR检测的癌症早筛、早诊、术后风险评估、动态监测和辅助判断疾病进程等领域。

技术研发人员：李慧,杨浩,张嫒媛,郗丽英,郑璐,王寅,白健,吴琳
受保护的技术使用者：北京和瑞精湛医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13