重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用的制作方法

本发明涉及人三型胶原蛋白，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。

背景技术：

1、胶原蛋白由原胶原组成，每个原胶原都有一种特殊的三重螺旋结构，由3条α螺旋的肽链缠绕而成，长度约为1000个氨基酸残基；每条α肽链通过左手螺旋缠绕，3条肽链一起形成一个大的右手螺旋结构。nokelainen等构建了两株杆状病毒表达系统，其中一株编码人ⅲ型原胶原α1链，另一株编码人p4h的α和β亚基，通过共感染昆虫细胞，成功表达了人胶原蛋白，并具有稳定三螺旋结构，表达量达50mg/l。由于动、植物细胞的培养难度大，成本高，想要大规模生产不太理想。因此，采用微生物作为宿主仍然是较为理想的选择。

2、vuorela等于1997年成功利用毕赤酵母表达了人ⅰ、ⅱ、ⅲ型胶原蛋白全序列。大量研究表明胶原蛋白与关键酶p4h在宿主细胞的共表达是一个较好的策略。使用α-mf信号肽也只能够极少量地提高其分泌量，同时又会减少ⅰ型胶原蛋白的表达总量。重组酵母表达得到的胶原分子其结构、性质等都接近于天然的胶原蛋白，同样也能在体外组装成胶原纤维，仅四基因的单拷贝重组子的胶原蛋白表达量就高达0.5g/l，比在同样条件下表达ⅰ型胶原蛋白提高了1.5～3倍。

技术实现思路

1、本发明人利用人源胶原蛋白iii型a1链目的基因的两端目的基因m1和m2与一段目的序列m3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，不仅表达量可达到5g/l，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。

2、第一方面，本发明提供了一种重组人三型胶原蛋白的制备方法，包括：

3、构建重组人三型胶原蛋白的重组表达质粒；

4、将所述重组质粒转入毕赤酵母，得到重组菌株；以及

5、对所述重组菌株进行诱导表达，收集发酵液，纯化即可得到所述重组人三型胶原蛋白；

6、其中，所述重组表达质粒的构建包括：

7、构建质粒puc57-m3；

8、依据所述质粒puc57-m3构建质粒puc57-m3-m1；

9、依据质粒puc57-m3-m1构建质粒puc57-m3-m1-m2；

10、依据质粒puc57-m3-m1-m2构建重组表达质粒ppiczαa-m3-m1-m2；

11、其中，m1、m2、m3的核苷酸序列依次如seq id no.1～3所示。

12、其中，构建质粒puc57-m3的步骤包括：

13、对m3序列进行pcr扩增，得到携带puc57同源臂的m3序列；

14、对puc57采用saci和bsp681进行使用的双酶切反应，得到puc57的线性化序列；

15、将携带puc57同源臂的m3序列与puc57的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒puc57-m3。

16、在m3序列进行pcr扩增过程中，采用m3-f和m3-r为引物对，m3-f和m3-r的核苷酸序列依次如seq id no.4～5所示。

17、其中，“依据所述质粒puc57-m3构建质粒puc57-m3-m1”的步骤包括：

18、对m1序列进行pcr扩增，得到携带puc57-m3同源臂的m1序列；

19、采用mpln103i和bamh1对puc57-m3进行双酶切，得到puc57-m3的线性化序列；

20、将携带puc57-m3同源臂的m1序列与puc57-m3的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒puc57-m3-m1。

21、在m1序列进行pcr扩增过程中，采用m1-f和m1-r为引物对，m1-f和m1-r的核苷酸序列依次如seq id no.6～7所示。

22、其中，“依据质粒puc57-m3-m1构建质粒puc57-m3-m1-m2”的步骤包括：

23、对m2序列进行pcr扩增，得到携带puc57-m3-m1同源臂的m2序列；

24、采用apai和psti对puc57-m3-m1进行双酶切，得到puc57-m3-m1的线性化序列；

25、将携带puc57-m3-m1同源臂的m2序列与puc57-m3-m1的线性化序列进行同源重组反应，得到质粒puc57-m3-m1-m2。

26、在m2序列进行pcr扩增过程中，采用m2-f和m2-r为引物对，m1-f和m1-r的核苷酸序列依次如seq id no.8～9所示。

27、第二方面，本发明提供了一种注射剂，包含第一方面所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂。

28、进一步地，所述注射剂还包含人重组音猬因子蛋白和透明质酸钠。

29、第三方面，本发明提供了第一方面所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白在制备医学美容产品中的应用。

30、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

31、本发明利用人源胶原蛋白iii型a1链目的基因的两端目的基因m1和m2与一段目的序列m3融合构建了重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株。并且通过对其发酵上清液进行提取，制得了一种注射剂。经细胞试验证实，该注射剂无细胞毒性，能够促进人成纤维细胞和角质形成细胞的增值和迁移，并且能够调节其胶原合成和降解相关基因的表达。经动物实验表明，该注射剂能够对光老化小鼠皮肤皱纹进行改善，皮肤屏障功能进行修复，是皮肤光老化治疗的一种较佳选择。

技术特征：

1.一种重组人三型胶原蛋白的制备方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，构建质粒puc57-m3的步骤包括：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，m3序列进行pcr扩增过程中，采用m3-f和m3-r为引物对，m3-f和m3-r的核苷酸序列依次如seq id no.4～5所示。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，“依据所述质粒puc57-m3构建质粒puc57-m3-m1”的步骤包括：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，m1序列进行pcr扩增过程中，采用m1-f和m1-r为引物对，m1-f和m1-r的核苷酸序列依次如seq id no.6～7所示。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，“依据质粒puc57-m3-m1构建质粒puc57-m3-m1-m2”的步骤包括：

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，m2序列进行pcr扩增过程中，采用m2-f和m2-r为引物对，m1-f和m1-r的核苷酸序列依次如seq id no.8～9所示。

8.一种注射剂，包含权利要求1～7任一所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白和不完全弗氏佐剂。

9.根据权利要求8所述的注射剂，其特征在于，还包含人重组音猬因子蛋白和透明质酸钠。

10.权利要求1～7任一所述的制备方法制得的重组人三型胶原蛋白在制备医学美容产品中的应用。

技术总结
本发明涉及人三型胶原蛋白技术领域，具体重组人三型胶原蛋白、注射剂及医学美容产品中的应用。通过构建重组表达质粒，并将该重组表达质粒转入毕赤酵母，得到高效胞外表达重组人三型胶原蛋白的菌株，通过该菌株诱导表达可得到该重组人三型胶原蛋白，不仅表达量可达到5g/L，而于菌株胞外表达，诱导表达条件宽泛，易于分离纯化；得到的重组人三型胶原蛋白能够作用医用美容产品的原料，前景可观。

技术研发人员：请求不公布姓名
受保护的技术使用者：广东瀚润生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13