一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用

本发明属于基因工程，具体涉及一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用。

背景技术：

1、我国饲料“禁抗令”已全面实施，饲料行业进入禁止使用抗生素的新时代，寻找更多、更好、更有效的抗生素替代品成为当务之急。噬菌体裂解酶是双链dna噬菌体感染后期在宿主体内合成的细胞壁水解酶，通过穿孔素蛋白，裂解酶到达宿主细胞肽聚糖层从而发挥裂解功能，最终宿主细胞裂解释放子代噬菌体。噬菌体裂解酶因其不易产生耐药性、作用专一、高效且特异性杀菌等优点成为研究的热点。现有技术中报道的猪链球菌前噬菌体裂解酶lys0859具有chap的催化结构域(ead)和sh3b的细胞壁结合结构域(cbd)。该裂解酶是半胱氨酸、组氨酸依赖性的酰胺水解酶。但是该裂解酶耐受胃肠道的环境能力极差，不稳定易降解，增加储存和运输成本。注射的给药途径给猪只带来较大的应激，不仅影响仔猪生产性能，而且操作不便，增加工作量和饲养成本。另一方面，噬菌体裂解酶的制备过程如纯化、破碎成本高。因此，亟需寻求制备噬菌体裂解酶的方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，不仅可耐受高温、强酸强碱、胃肠道的环境而且具有良好的特异杀菌活性，为预防猪链球菌感染，提供新型替抗制剂。

2、本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶lys0859。

3、优选的，所述芽孢杆菌锚定蛋白为cotg蛋白；

4、所述cotg蛋白的氨基酸序列如seq id no：1所示。

5、优选的，所述前噬菌体裂解酶lys0859的氨基酸序列如seq id no：2所示。

6、优选的，所述锚定蛋白和前噬菌体裂解酶lys0859形成的融合蛋白的氨基酸序列seq id no：3所示。

7、优选的，所述重组芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌168标准菌株。

8、本发明提供了一种所述重组芽孢杆菌的构建方法，包括以下步骤：

9、制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶lys0859形成的融合基因；

10、将所述融合基因克隆至穿梭质粒中，得到重组质粒；

11、将所述重组质粒转化芽孢杆菌宿主菌中，得到展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌。

12、优选的，所述制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶lys0859形成的融合基因的方法包括分别扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因和前噬菌体裂解酶lys0859的编码基因，通过重叠pcr扩增，得到融合基因cotg-0859。

13、优选的，扩增芽孢杆菌锚定蛋白的编码基因的引物包括核苷酸序列如seq id no：4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：5所示的反向引物；

14、扩增前噬菌体裂解酶lys0859的编码基因的引物包括核苷酸序列如seq id no：6所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：7所示的反向引物；

15、重叠pcr扩增用引物包括核苷酸序列如seq id no：4所示的正向引物和核苷酸序列如seq id no：7所示的反向引物。

16、优选的，所述融合基因整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中。

17、本发明还提供了所述重组芽孢杆菌产生的重组芽孢。

18、本发明提供了所述重组芽孢杆菌、所述构建方法得到的重组芽孢杆菌或所述重组芽孢在制备抗菌剂或饲料中的应用，所述抗菌剂优选包括以下至少一种：猪链球菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂、李斯特菌抑菌剂和产气荚膜梭菌抑菌剂。

19、本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶lys0859。所述重组芽孢杆菌在内生芽孢形成时前噬菌体裂解酶lys0859基因随着锚定蛋白的表达从而得以成功地展示在芽孢表面。本发明利用sds-page、western-blot、荧光免疫分析鉴定证明，前噬菌体裂解酶成功固定在芽孢表面。为了验证外源蛋白是否影响芽孢的功能，本发明测定野生型菌株和重组菌株的产酶定性实验、生长曲线、产芽孢率，结果表明，融合蛋白的表达不会影响芽孢杆菌的产芽孢功能。此外通过高温、强酸强碱、乙醇、人工胃液、人工肠液、胆盐、金属离子、edta处理重组芽孢，测定芽孢的稳定性，结果表明重组芽孢对上述环境具有较强的耐受性。同时，所述重组芽孢杆菌由于表面展示表达前噬菌体裂解酶，对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌具有良好的抑菌作用。可见，本发明提供的重组芽孢杆菌产生的重组芽孢不仅具有稳定的环境适应性而且保持良好的特异性杀菌性能，为开发预防猪链球菌感染提供抗菌剂，同时在口服接种和储存以及运输方面均具有独特的优势。

技术特征：

1.一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌，其特征在于，在芽孢杆菌的锚定蛋白表面展示前噬菌体裂解酶lys0859。

2.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述芽孢杆菌锚定蛋白为cotg蛋白；

3.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述前噬菌体裂解酶lys0859的氨基酸序列如seq id no:2所示。

4.根据权利要求1所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述锚定蛋白cotg和前噬菌体裂解酶lys0859形成的融合蛋白的氨基酸序列seq idno:3所示。

5.根据权利要求1～4中任意一项所述重组芽孢杆菌，其特征在于，所述重组芽孢杆菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌168标准菌株。

6.一种权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述构建方法，其特征在于，所述制备芽孢杆菌锚定蛋白和前噬菌体裂解酶lys0859形成融合基因的方法包括分别扩增芽孢杆菌锚定蛋白cotg的编码基因和前噬菌体裂解酶lys0859的编码基因，通过重叠pcr扩增，得到融合基因cotg-0859；

8.根据权利要求6或7所述构建方法，其特征在于，所述融合基因整合至枯草芽孢杆菌宿主菌基因组中的淀粉酶基因中。

9.权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌产生的重组芽孢。

10.权利要求1～5中任意一项所述重组芽孢杆菌、权利要求6～8中任意一项所述构建方法得到的重组芽孢杆菌或权利要求9所述重组芽孢在制备抗菌剂或饲料中的应用，所述抗菌剂优选包括以下至少一种：猪链球菌抑菌剂、金黄色葡萄球菌抑菌剂、李斯特菌抑菌剂和产气荚膜梭菌抑菌剂。

技术总结
本发明提供了一种展示猪链球菌前噬菌体裂解酶的重组芽孢杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明将枯草芽孢杆菌编码锚定蛋白cotG基因与编码前噬菌体裂解酶Lys0859基因融合，在枯草芽孢杆菌中进行外源表达，获得表面展示前噬菌体裂解酶Lys0859的重组枯草芽孢杆菌。所述重组枯草芽孢杆菌产生的芽孢可耐受高温、强酸强碱、胃肠道的环境，同时对猪链球菌、金黄色葡萄球菌、李斯特菌、产气荚膜梭菌等革兰氏阳性菌具有抑菌效果，可作为新型的替抗制剂。重组芽孢在应用于猪链球菌感染时，可通过口服接种，同时在储存和运输方面有极大便利，还具有节约生产成本的特点。

技术研发人员：钱平,朱梦媛,李祥敏,李鑫鑫,王林康
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13