还原胺化酶突变体及其在烷基化吡咯烷手性胺合成中的应用

本发明属于酶工程，具体涉及五种还原胺化酶突变体在r和s构型的烷基化吡咯烷胺合成中的应用。

背景技术：

1、手性胺作为重要的结构单元和药效基团广泛应用于制药领域。经典的化学方法主要依赖于手性拆分和活化手性醇的亲核置换。化学催化还原胺化反应也是常用的方法，但其往往需要用到昂贵的过度金属催化剂，并且在反应完成后难以除去。生物催化剂为绿色高效合成手性胺提供了新的选择。依赖于nadph的还原胺化酶(redams)是合成烷基化手性胺最具吸引力的生物催化剂之一。自nicholas j.turner在2017年定义redam以来，根据报道它催化等量的前手性酮或醛和胺进行还原胺化反应生成仲胺或叔胺，这是生成烷基胺最直接的策略。值得注意的是，据报道，redams可以接受广泛的酮类和胺类，并成功应用于lsd1抑制剂gsk2879552和jak1抑制剂abrocitinib的工业化制造。

2、由于药物分子中对映体立体结构的不同，其在生物系统中表现往往有很大差异，因此高效的不同构型的手性胺是制药工业的重要任务。r和s选择性的redams能够以高度的立体选择性不对称合成各种光学纯手性胺。为了获得这两种光学纯对映体，通常需要筛选大量的酶库以获得互补的立体选择性酶。然而，目标天然酶由于催化效率低或热稳定性差，不适合工业应用。在这种情况下，需要对互补立体选择性酶进行大量的工程化改造以满足工业工艺的要求。酶的理性设计通常集中在少数潜在氨基酸上，这样可以显著减少待测突变体的数量。尽管在调节酶催化效率方面已经取得了一些进展，用于立体发散还原胺化合成两种立体异构体的redams的理性设计方法还有待开发。

3、吡咯烷胺在许多药物中都是重要的官能团，包括ceftobiprole、tomopenem(cs-023)、leniolisib、clinafloxacin和tosufloxacin。发明人在前期研究中，从actinoalloteichus hymeniacidonis中克隆得到一个还原胺化酶ir-g36，经过活性中心的工程化改造获得了突变体m5，用于催化还原胺化合成一系列的烷基化哌啶酮手性胺和氮杂卓环手性胺，其立体选择性和转化率高达99％。但是，当使用n-boc-3-吡咯烷酮作为酮供体时，m5表现出较差的立体选择性，ee值为44％(r)。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种还原胺化酶突变体，其具有氨基酸序列如seq idno.3-12所示的v1、v2、v3、v4、v5。

2、本发明还提供了还原胺化酶突变体v1、v2、v3、v4、v5在酮与胺合成烷基吡咯烷性胺的反应中的应用，所述酮为n-boc-3-吡咯烷酮；所述胺为r2-nh2，其中，r2为x为1-10的整数。

3、在本发明的具体实施例中，所述反应中加入酮与胺的物质的量比为1:1.1。

4、在本发明的具体实施例中，所述反应中加入还原胺化酶突变体的细胞裂解液，所述还原胺化酶突变体细胞湿重与反应混合液的质量体积比为10g/l；所述d-葡萄糖与酮的物质的量比为1.5：1；所述反应中加入nadp+的量为1.0mm/l；葡萄糖脱氢酶gdh酶粉的量为1.5mg/l；磷酸盐的量为100mm/l；所述dmso的体积用量是反应液总体积的20％。

5、在本发明的具体实施例中，所述反应的溶液ph 7.0。

6、在本发明的具体实施例中，所述反应的温度为30℃。

7、在本发明的具体实施例中，所述反应的时间为24小时。

8、在本发明的具体实施例中，所述反应的步骤包括：将体积比为1:4的dmso和磷酸钠缓冲液加入反应器中；将胺、d-葡萄糖和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸二钠盐的混合液加入反应器中，在30℃条件下反应；所述n-boc-3-吡咯烷酮的加入量为100-110mm/l；所述胺与酮的物质的量比为1.1:1；将还原胺化酶突变体v1-v5的细胞裂解液和gdh酶粉添加到反应溶液中反应；反应24小时后得产物。

9、在本发明的具体实施例中，在反应24小时后得产物之后还包括步骤：用乙酸淬灭反应并搅拌以得到ph 3.0的溶液；将硅藻土装入生物反应器并搅拌10分钟；过滤混合物并用水冲洗得滤液；滤液依次用二氯甲烷萃取、用饱和碳酸钠将水相碱化至ph 10、用二氯甲烷萃取得有机相萃取液；减压除去合并的有机萃取物的溶剂。

10、本发明通过半理性设计酶的活性中心，在前期研究基础上进行工程化改造，获得突变体v1-v5，通过一系列烷基化手性吡咯烷胺的合成证明了其高选择性、高转化率以及优秀的底物兼容性。

技术特征：

1.还原胺化酶突变体，其特征在于，所述还原胺化酶突变体为突变体v1、突变体v2、突变体v3、突变体v4、或突变体v5；

2.权利要求1所述还原胺化酶突变体在催化n-boc-3-吡咯烷酮和胺的还原胺化反应中的应用。

3.依据权利要求2所述还原胺化酶突变体在催化n-boc-3-吡咯烷酮和胺的还原胺化反应中的应用，其特征在于，

4.依据权利要求2所述还原胺化酶突变体在催化n-boc-3-吡咯烷酮和胺合成烷基化吡咯烷手性胺中的应用，其特征在于，

5.依据权利要求2所述还原胺化酶突变体在催化n-boc-3-吡咯烷酮和胺合成烷基化吡咯烷手性胺中的应用，其特征在于，

技术总结
本发明属于酶工程技术领域。本发明公布了一种还原胺化酶突变体，所述还原胺化酶突变体为突变体V1、突变体V2、突变体V3、突变体V4、或突变体V5；所述突变体V1的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述突变体V2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述突变体V3的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述突变体V4的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；所述突变体V5的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。本发明提供的突变体在还原胺化反应中转化率高达99％，立体选择性高达99％，具有很好的工业化应用前景。

技术研发人员：高书山,张军,崔成森,马亚卿,朱芳芳
受保护的技术使用者：中国科学院天津工业生物技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12