用于检测大青褶伞的引物对、试剂盒及其应用的制作方法

本公开属于生物检测，具体地，本公开涉及用于检测大青褶伞的引物对、用于检测大青褶伞的试剂盒、检测大青褶伞的方法及其应用。

背景技术：

1、大青褶伞(chlorophyllum molybdites(g.mey.)massee)是一种大型真菌，又称为青褶伞、铅绿褶菇、绿褶菇等，隶属于蘑菇科(agaricaceae)、青褶伞属(chlorophyllum)、青褶伞组(sect.chlorophyllum)。全世界共记载并被承认的青褶伞属的种类超过20种，是温带和亚热带地区常见的野生大型真菌类群之一。在中国，目前共报道青褶伞属有8种，其中毒蘑菇4种，均可造成胃肠炎型(gastroenteritis)中毒，分别为球盖青褶伞(c.globosum(mossebo)vellinga)、变红青褶伞(c.hortense(murrill)vellinga)、大青褶伞(c.molybdites(g.mey.)massee)和乳头青褶伞(c.neomastoideum(hongo)vellinga)；食用菌1种，为陀螺青褶伞(c.agaricoides(czern.)vellinga)。

2、大青褶伞分布广泛，亚洲、北美洲、南美洲、大洋洲、非洲和欧洲都有分布，群生或散生于阔叶树林地上、林缘草地上。该种常见于菜地里，路边草地、荒地，锯末堆上，在城市常见于公园内，小区草坪上。它是离人群最近的毒蘑菇种类。

3、大青褶伞可引起胃肠炎型中毒，其毒素是一种被称为molybdophyllysin(的蛋白，该蛋白经腹腔注射可在3h内引起小鼠腹腔大量出血而死亡。大青褶伞也引起人类中毒。大青褶伞是最常被人误食的毒蘑菇之一。

4、目前，大青褶伞的鉴别多为形态学鉴别或利用色谱法进行毒性成分检测，然而，形态学鉴别非专业人士难以掌握，色谱法较为复杂且耗时较长。

技术实现思路

1、本公开的目的在于提供一种用于检测大青褶伞(chlorophyllum molybdites(g.mey.)massee)的引物对，以快速准确地检测大青褶伞。

2、第一方面，本公开提供了一种用于检测大青褶伞(chlorophyllum molybdites(g.mey.)massee)的引物对，所述引物对包括：

3、seq id no:1所示的上游引物cm-f，和

4、seq id no:2所示的下游引物cm-r。

5、在一些实施方式中，所述引物对以大青褶伞的总dna为模板，通过pcr扩增对大青褶伞进行检测。

6、第二方面，本公开提供了一种用于检测大青褶伞的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面提供的引物对。

7、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括探针。

8、在一些实施方式中，所述探针的核酸序列如seq id no:3所示。

9、在一些实施方式中，所述探针具有荧光报告基团和荧光淬灭基团。

10、在一些实施方式中，所述探针的5'端标记有荧光报告基团，所述探针的3'端标记有荧光淬灭基团。

11、在一些实施方式中，所述荧光报告基团选自fam基团、vic基团、joe基团和hex基团；

12、所述荧光淬灭基团选自tamar基团、bhq1基团、bhq2基团和mgb基团。

13、在一些实施方式中，所述荧光报告基团为fam基团，所述荧光淬灭基团为mgb基团。

14、在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品。

15、在一些实施方式中，所述阴性对照品为不含有大青褶伞的基因组dna，阳性对照品为含有大青褶伞的基因组dna。

16、第三方面，本公开提供了一种检测大青褶伞的方法，所述方法包括：

17、1)以待测样品的总dna为模板，利用第一方面提供的引物对或第二方面提供的试剂盒进行pcr扩增。

18、在一些实施方式中，所述pcr扩增的退火温度为58～62℃。

19、在一些实施方式中，所述方法还包括：2)判断所述待测样品中是否含有大青褶伞。

20、在一些实施方式中，步骤2)为判断所述待测样品中是否含有大青褶伞阴性对照品的ct值大于或等于第一阈值，且阳性对照品的ct值小于或等于第二阈值，则所述检测结果有效；

21、如果所述待测样品的ct值≥所述第一阈值，则所述待测样品中不含有大青褶伞；

22、如果所述待测样品的ct值≤所述第二阈值，则所述待测样品中含有大青褶伞；

23、如果所述待测样品的ct值大于所述第二阈值且小于所述第一阈值，则重复步骤1)和步骤2)，如果所述待测样品的ct值＜所述第一阈值，则所述待测样品含有大青褶伞。

24、在一些实施方式中，所述第一阈值可以为40，所述第二阈值可以为36。

25、第四方面，本公开提供了第一方面提供的引物对或第二方面提供的试剂盒在检测大青褶伞中的应用。

26、本公开提供的用于检测大青褶伞(chlorophyllum molybdites(g.mey.)massee)的引物对，能够快速准确地检测大青褶伞。

技术特征：

1.一种用于检测大青褶伞的引物对，其特征在于，所述引物对包括：

2.根据权利要求2所述的引物对，其特征在于，所述引物对以大青褶伞的总dna为模板，通过pcr扩增对大青褶伞进行检测。

3.一种用于检测大青褶伞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的引物对。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括探针；

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针具有荧光报告基团和荧光淬灭基团；

6.根据权利要求3至5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照品和阳性对照品，优选还包括空白对照品。

7.一种检测大青褶伞的方法，其特征在于，所述方法包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增的退火温度为58～62℃。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：2)判断所述待测样品中是否含有大青褶伞；

10.权利要求1或2所述的引物对或权利要求3至6任一项所述的试剂盒在检测大青褶伞中的应用。

技术总结
本公开涉及用于检测大青褶伞的引物对、试剂盒及其应用。本公开提供的用于检测大青褶伞的引物对包括：SEQ ID NO:1所示的上游引物CM‑F，和SEQ IDNO:2所示的下游引物CM‑R。该引物对能够快速准确地检测大青褶伞。

技术研发人员：章轶哲,李海蛟,张宏顺,孙承业,梁嘉祺
受保护的技术使用者：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13