一种发酵生产AspochalasinD的方法

本发明涉及一种发酵生产aspochalasin d的方法,属于微生物和发酵。

背景技术：

1、aspochalasin d是一种聚酮氨基酸杂合的天然产物，其主要来源之一是黄柄曲霉。该化合物具有典型的细胞松弛素活性，能够特异性结合肌动蛋白。此外，该化合物还具有抗菌、抗癌、抗污以及抑制5羟色胺释放等活性。因此在农业和药物开发方面具有巨大的应用前景。

2、目前，aspochalasin d有化学合成和微生物发酵两种方法制备。化学合成方法步骤繁多且反应条件复杂，难以高效制备。微生物发酵法受限于野生型菌株有限的合成能力且还有其他副产物产生，导致发酵产量低下。因此，急需开发一种高效发酵生产aspochalasind的方法。

技术实现思路

1、由于野生型黄柄曲霉的aspochalasin d产量低且副产物较多，而目前没有方法能有效提高aspochalasin d产量。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种发酵生产aspochalasind的方法。此方法通过发酵工艺优化和基因编辑技术,提高黄柄曲霉aspochalasin d的生产效率，减少黄柄曲霉合成aspochalasin d的副产物。利用本发明的方法提高了黄柄曲霉的aspochalasin d的产量。

3、本发明提供了一种重组黄柄曲霉，所述重组黄柄曲霉是以黄柄曲霉cgmcc3.17641为表达宿主，敲除其基因组上的aspoa基因，并且整合表达了含有来源于自身的转录调控因子aspog的过表达盒。

4、在本发明的一种实施方式中，所述aspoa基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5、在本发明的一种实施方式中，所述表达盒由来自构巢曲霉的启动子pgpda、终止子tcgra和aspog基因构成，所述表达盒的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明还提供了一种发酵生产aspochalasin d的方法，所述方法为，将所述的黄柄曲霉cgmcc 3.17641或所述重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，发酵制备aspochalasind。

7、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：10-50g/l葡萄糖、1-5g/l大豆蛋白胨、1-3g/l乙酸钠、0.5-3g/l亮氨酸、1-9mg/l l-苯丙氨酸、20-180mg/l苯甲酸钠、100-200mg/l磷酸二氢钾、0.5-1.5mg/l生物素、3-10mg/l硝酸钙、0.5-1.5mg/l磷酸吡哆醛、0.5-1.5mg/l泛酸钙、0.5-1.5mg/l盐酸硫胺素、1-9mg/l氯化锰、1-3mg/l氯化铁、0.5-1.5mg/l硝酸铜、0.5-4.5mg/l硫酸镁、1-4mg/l硫酸锌。

8、在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基包括：25.2/l葡萄糖、3g/l大豆蛋白胨、1g/l乙酸钠、1.4g/l亮氨酸、5mg/l l-苯丙氨酸、100mg/l苯甲酸钠、136mg/l磷酸二氢钾、1mg/l生物素、6.5mg/l硝酸钙、1mg/l磷酸吡哆醛、1mg/l泛酸钙、1mg/l盐酸硫胺素、5mg/l氯化锰、2mg/l氯化铁、1mg/l硝酸铜、3.6mg/l硫酸镁、2.5mg/l硫酸锌。

9、在本发明的一种实施方式中，所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉的添加量为：106～108个孢子。

10、在本发明的一种实施方式中，将所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为21～31℃，初始ph为6.0-8.0，转速为100～160r/min的条件下进行发酵。

11、在本发明的一种实施方式中，将所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为29℃，初始ph为6.0-8.0，转速为135r/min的条件下进行发酵。

12、本发明还提供了上述重组黄柄曲霉或上述黄柄曲霉cgmcc 3.17641在制备aspochalasin d或含有aspochalasin d产品中的应用。

13、有益效果

14、本发明对温度、时间、ph、碳源、氮源、亮氨酸浓度等发酵工艺优化，并使用敲除aspoa基因并过表达aspog基因获得的黄柄曲霉δaspoa::oeaspog突变株，大幅提升了aspochalasin d的产量。利用本发明方法发酵生产aspochalasin d，可以使aspochalasind的产量最高达到812.1mg/l，在农业和制药业方面具有巨大的应用前景。

技术特征：

1.一种重组黄柄曲霉，其特征在于，所述重组黄柄曲霉是以黄柄曲霉cgmcc 3.17641为表达宿主，敲除其基因组上的aspoa基因，并整合表达了含有来源于黄柄曲霉的转录调控因子aspog的过表达盒。

2.根据权利要求1所述的重组黄柄曲霉，其特征在于，所述aspoa基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的重组黄柄曲霉，其特征在于，所述含有来源于黄柄曲霉的转录调控因子aspog的过表达盒的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4.一种发酵生产aspochalasin d的方法，其特征在于，所述方法为，将权利要求1所述的黄柄曲霉cgmcc 3.17641或权利要求1～3任一所述的重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，发酵制备aspochalasin d。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括：10-50g/l葡萄糖、1-5g/l大豆蛋白胨、1-3g/l乙酸钠、0.5-3g/l亮氨酸、1-9mg/l l-苯丙氨酸、20-180mg/l苯甲酸钠、100-200mg/l磷酸二氢钾、0.5-1.5mg/l生物素、3-10mg/l硝酸钙、0.5-1.5mg/l磷酸吡哆醛、0.5-1.5mg/l泛酸钙、0.5-1.5mg/l盐酸硫胺素、1-9mg/l氯化锰、1-3mg/l氯化铁、0.5-1.5mg/l硝酸铜、0.5-4.5mg/l硫酸镁、1-4mg/l硫酸锌。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为：25.2/l葡萄糖、3g/l大豆蛋白胨、1g/l乙酸钠、1.4g/l亮氨酸、5mg/l l-苯丙氨酸、100mg/l苯甲酸钠、136mg/l磷酸二氢钾、1mg/l生物素、6.5mg/l硝酸钙、1mg/l磷酸吡哆醛、1mg/l泛酸钙、1mg/l盐酸硫胺素、5mg/l氯化锰、2mg/l氯化铁、1mg/l硝酸铜、3.6mg/l硫酸镁、2.5mg/l硫酸锌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉的添加量为：106～108个孢子。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为21～31℃，初始ph为6.0-8.0，转速为100～160r/min的条件下进行发酵。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，将所述黄柄曲霉cgmcc 3.17641或重组黄柄曲霉添加至发酵培养基中，在温度为29℃，初始ph为6.0-8.0，转速为135r/min的条件下进行发酵。

10.权利要求1～3任一所述的重组黄柄曲霉在制备aspochalasin d或含有aspochalasin d产品中的应用。

技术总结
本发明公开了一种发酵生产Aspochalasin D的方法，属于微生物和发酵技术领域。此方法通过对黄柄曲霉液体发酵条件进行优化，并通过aspoA基因敲除以及aspoG基因过表达得到突变菌株ΔaspoA::OEaspoG菌株，利用本发明的发酵方法生产Aspochalasin D,可使得Aspochalasin D的产量达到812.1mg/L。本发明通过黄柄曲霉突变菌株发酵得到的细胞松弛素Aspochalasin D具有抗菌、抗癌等多种活性，可以将其应用于农业和制药业。

技术研发人员：饶义剑,袁振波,杨兆鹏,刘会灵,苏增平,许会宾
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12