一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用

本发明属于酶工程，具体涉及一种角质酶突变体及其对pet高效降解的应用。

背景技术：

1、塑料工业的迅猛发展改变了人们传统的生产、生活方式，给人们的生活带来了极大的便利，但产生的大量塑料垃圾在自然环境中不断累积，给全球的生态环境造成了严重的负担。每年有大量的塑料垃圾进入海洋生态系统，给海洋的鸟类、鱼类等生物造成了严重的生存威胁。聚对苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene glycol terephthalate，pet)由石油衍生的对苯二甲酸和乙二醇为材料合成，具有烃链长、分子量高、气体渗透性低、难降解等特点。因生产成本低、耐用性好和使用简便等优点，pet成为使用量最多的聚酯材料，全球一半以上的合成纤维和塑料瓶由pet制成。由于pet分子的主链上存在芳香族化合物而难以自然降解，发展pet塑料的绿色降解处理技术对于全球生态环境保护等具有重要的意义。

2、角质酶(cutinase)属于α/β折叠水解酶超家族，具有丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸残基组成的催化三联体，是目前有效降解pet的重要酶类。在酶的作用下pet被降解为对苯二甲酸乙二醇酯(bhet)、对苯二甲酸单乙二醇酯(mhet)和对苯二甲酸(tpa)，可被有效回收再利用。pet塑料的玻璃化温度为76℃，在高温下稳定的角质酶，是降解pet的重要类群。蛋白质工程改造角质酶，可明显的提高野生型酶的pet降解活力，热稳定性和环境适应潜力。海洋类诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511来源的角质酶sccut，最适酶反应温度为70℃，但活性相对较低。因此，本专利通过结构分析构建了具备高活性的突变体，在环境中废pet塑料降解中表现出较好工业应用潜力。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的是提供一种角质酶突变体，其氨基酸序列如seq id no.2所示。所述的角质酶突变体，是在seq id no.1所述的野生型角质酶基础上，将第239位苯丙氨酸替换为丙氨酸。

2、本发明的第二个目的是提供一种编码上述角质酶突变体的编码基因。优选，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

3、本发明的第三个目的是提供一种含有上述编码基因的重组载体。

4、本发明的第四个目的是提供一种含有上述重组载体的重组工程菌。

5、优选，所述重组工程菌为大肠杆菌。

6、优选，所述大肠杆菌为bl21(de3)。

7、本发明的第五个目的是提供上述角质酶突变体、上述重组载体或上述重组工程菌在pet降解中的应用。

8、本发明的第六个目的是提供一种降解pet的方法，是用上述角质酶突变体与pet进行反应。

9、优选，所述角质酶突变体的浓度为1mg/ml。

10、本发明通过分子对接模拟确定了角质酶与底物的结合口袋，发现了影响活性的关键氨基酸残基(239位)，通过定点突变提升了pet的催化效率，提高了降解产物的释放量。与野生型菌株相比，角质酶突变体催化产物提升了42.6倍，降解活性超过了世界最好降解活性酶之一的iccg，在降低生产成本，提高生产效率等方面显示出更好的工业应用潜力。

11、诺卡氏菌nocardioides sp.scsio 66511保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号cgmcc no.26044，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为：2022年12月4号。

技术特征：

1.一种角质酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.一种编码权利要求1所述的角质酶突变体的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq id no.4所示。

4.一种含有权利要求2所述的编码基因的重组载体。

5.一种含有权利要求4所述的重组载体的重组工程菌。

6.根据权利要求5所述的重组工程菌，其特征在于，所述重组工程菌为大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的重组工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌为bl21(de3)。

8.权利要求1所述的角质酶突变体、权利要求4所述的重组载体或权利要求5所述的重组工程菌在pet降解中的应用。

9.一种降解pet的方法，其特征在于，是用权利要求1所述的角质酶突变体与pet进行反应。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述角质酶突变体的浓度为1mg/ml。

技术总结
本发明公开了一种角质酶突变体及其对PET高效降解的应用。所述角质酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，是将SEQ ID NO.1所示的野生型角质酶的氨基酸序列第239位的苯丙氨酸替换为丙氨酸。本发明构建的角质酶突变体通过在大肠杆菌中表达，突变酶的活性与野生型酶相比，稳定性增加，催化效率提升，PET塑料(聚对苯二甲酸乙二醇酯，PET)降解产物的产量增加了42.6倍。改造后的角质酶突变体，提高PET降解效率，可降低生产成本，更适合工业应用。

技术研发人员：田新朋,石松标,李青连,杨键,刘玉,曾琦,殷建平,龙丽娟
受保护的技术使用者：中国科学院南海海洋研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/12