本发明涉及香附中活性成分制备方法及其在抗炎药物中的应用。
背景技术:
1、香附(nutgrass,family:cyperaceae)广泛分布于全球亚热带和热带地区[1,2]。在古代中医药文化中,其根茎被广泛用于治疗不同的疾病,包括便秘、痢疾和腹胀。它是已知最早的重要的食用植物,并且具有广泛的药理作用,如抗炎[6],解热,镇痛[7]和抗疟[8]。
2、中药化学研究表明,该植物主要含有倍半萜类[9]、类黄酮[10]、皂苷[11]和生物碱[12]。倍半萜类是香附中最具代表性的成分[13]。在《中国药典》中,α-环哌酮作为香附质量控制的指标化合物。香附中倍半萜具有广泛的抗炎活性,如抑制nf-κb、stat3通路和ros应激介导的炎症信号[14,15],潜在的抗炎抑制剂5-lo和lta4h酶[16],以及抑制氧化应激作用[17]。
3、研究表明,倍半萜的功能与大量活性成分的存在有关。此外,科学家们还应用了多种策略来分离和分离香附中的倍半萜,如硅胶柱色谱技术[18]、硅胶和sephadex lh-20组合技术[19]以及制备高效液相色谱技术[20]。然而,由于倍半萜的结构极化程度较低且结构相似,因此从香附中分离倍半萜具有挑战性。高速逆流色谱(high-speedcountercurrent chromatography,hsccc)是一种根据液液分配原理在天然产物研究中快速发展的技术,也被应用于各种天然产物的制备分离和纯化[21-23]。此外,与固相色谱和常规液液萃取技术相比,hsccc具有无不可逆吸附、进样回收率高、容量大、样品变性风险低、溶剂消耗低等优点。
技术实现思路
1、本发明提供香附中活性成分制备方法及其在抗炎药物中的应用,解决技术问题是有效将香附中活性成分进行提取。
2、为了解决上述技术问题,本发明采用以下技术方案:
3、香附中活性成分制备方法,按照以下步骤进行:
4、香附粗提取物的制备:将香附晾晒后粉碎,使用石油醚在室温下提取2次,每次24h,每隔3h搅拌1次,经过滤、减压浓缩、冷冻干燥即得香附粗提物;
5、溶剂制备:将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比1:0.1~0.4:1:0.1~0.4混匀,静置分层,得溶剂,其中上层为上相,下层为下相;
6、制备样品溶液:向香附粗体物中加入上相和下相,超声溶解,即得样品溶液;
7、高速逆流色谱:采用hsccc的首尾洗脱模式对样品溶液进行分离,上相作固定相,下相作流动相,超声脱气,打开冷肼,温度设定为25℃,以30ml/min的流速将固定相泵入到色谱柱中,完全充满后,正转调节转速850rpm,流动相以2ml/min的流速开始平衡,至达到流体力学平衡;样品溶液通过进样阀手动注入到色谱柱中,设置紫外检测器吸光度254nm处连续监测,并打开记录仪记录色谱数据图;
8、在连续注射方式下,以5.0ml/min的流速将下相泵入,所有峰洗脱一次分离后,再注入样品溶液进行下次分离;通过254nm紫外检测器,不断观察柱出口流出液,根据记录的洗脱剖面收集峰组分,将气体注入柱内吹出溶剂,将流出液在旋转蒸发器中浓缩直至干燥,以获得用于二维分离的样品;
9、内循环模式分离:采用六通阀连接离线二维分离模式,首先设置六通阀,在850rpm的转速下,将固定相以30ml/min的速度泵入设备,流动相以2.0ml/min的速度泵入,平衡后将用于二维分离的样品溶液注入,洗脱目标峰后,将六通阀设置为内循环模式,进行多次循环分离,通过自动收集器连续收集洗脱液,根据色谱图将每个峰馏分分别收集到试剂瓶中,减压浓缩收集的馏分,即得萜类化合物;
10、所述香附和石油醚的质量体积比为1:20kg/l;
11、香附粗体物、上相和下相的质量体积比为200mg:10ml:10ml;
12、所述用于二维分离的样品溶液是将上相和下相加入到用于二维分离的样品中,进行超声溶解后获得;用于二维分离的样品、上相和下相的质量体积比200mg:10ml:10ml;
13、所述香附中倍半萜类化合物化学式分别为
14、
15、所述溶剂中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比1:0.2:1:0.2。
16、还包括对萜类化合物进行检测,其检测方法为:
17、色谱柱:shim-pack vp-ods色谱柱(250mm×4.6mm;5μm);流动相:a-乙腈,b-水;梯度洗脱条件为:0-15min,20-40%a,80-60%b;15-20min,40-60%a,60-40%b;20-30min,60%a,40%b;30-40min,60-70%a,40-30%b;40-45min,70-100%a,30-0%b;45-50min,100-40%a,0-60%b;50-51min,40-20%a,60-80%b;51-60min,20%a,80%b;流速:1ml/min;柱温:25℃;检测波长:254nm;进样量:10μl。
18、还包括对萜类化合物进行结构鉴定,其方法为:
19、通过1h和13c nmr波谱鉴定分离的化合物,核磁波谱在bruker av-400波谱仪上记录,以dmso-d6作为溶剂,四甲基硅烷(tms)作内标物,化学位移(δ)值用ppm表示,耦合常数(j)以hz为单位。
20、如权利要求1至4任意一项所述香附中活性成分在抗炎药物中的应用。
21、发明具有以下有益技术效果:
22、本研究旨在开发一种有效的二维hsccc方法,结合连续注射和内循环模式来分离香附中的倍半萜。此外,我们评估了它们的药理功能特性,包括抗炎活性和分子对接特性。
1.香附中活性成分制备方法,其特征在于,按照以下步骤进行:
2.如权利要求1所述香附中活性成分制备方法,其特征在于,所述溶剂中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比1:0.2:1:0.2。
3.如权利要求1所述香附中活性成分制备方法,其特征在于,还包括对萜类化合物进行检测,其检测方法为:
4.如权利要求1所述香附中活性成分制备方法,其特征在于,还包括对萜类化合物进行结构鉴定,其方法为:
5.如权利要求1至4任意一项所述香附中活性成分在抗炎药物中的应用。