一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法与流程

本发明属于生物，尤其是涉及一种基于microrna制备诱导性多能干细胞的方法。

背景技术：

1、诱导性多能干细胞（ipscs）技术是通过向终末分化细胞导入特定的转录因子，通过特定基因的表达将体细胞逆转为多能干细胞，使其具备类似于胚胎干细胞的全能性及无限增殖特性。

2、ipscs技术开发早期多采用整合病毒载体介导来实现上述细胞逆转过程。最初使用“逆转录酶病毒”为载体向体细胞中植入几种转录因子基因，通过这些转录因子表达对细胞实现基因重编程，最终获得ips细胞。而这种方法的缺陷是增加了宿主细胞基因组不稳定性风险，有可能会由于外源基因插入细胞基因组，而干扰了内源基因的表达，从而诱发癌症。慢病毒载体(lv)比逆转录病毒载体更有效，它具有广泛的亲和性，重编程效率高达0.1-1%，但同样，此策略的安全性有待提高。

3、随着ips技术不断发展，以及人们对其衍生的细胞产品用于药物开发及临床应用的迫切期望，科学家们正在积极的通过不同策略开发安全性更高的ipscs诱导技术，以达到有效治疗应用的安全性和产品质量标准要求。目前已开发出的安全性更高的ips技术策略分为通过病毒、非病毒方法介导的非整合转移系统重编程。

4、目前，腺病毒等非整合病毒载体介导的重编程技术已成功开发，大量数据证明此方法未造成宿主基因组中外源dna插入。然而，目前非整合病毒载体传递方法的重编程效率仅限于0.001%。另一种替代方法是使用负性单链rna仙台病毒(se-v)，因为它在许多类型的细胞和组织中导入外源基因非常有效。然而，这种方法受到了低重编程效率的阻碍。

5、非病毒方法主要包括：质粒法、化学小分子法、mirna法等。质粒法是目前临床研究中使用较普遍的方法，利用质粒替代了传统的病毒载体，将转录因子基因导入细胞内部，但仍存在整合及外源基因残留风险，且重编程效率低等问题。为降低外源基因残留风险，通常需多次传代筛选来去除质粒残留，耗时耗力，同时增加了筛选成本。化学小分子法和mirna法不涉及基因编辑等过程，无基因整合风险，是未来临床应用最有希望的技术策略，但二者诱导效率不理想，较慢病毒载体(lv)诱导率低5-10倍。其中，化学小分子法突出优势为添加过程简单，但单独使用诱导效率较低，目前已报道的成功案例不多，通常与其他方法联用以提高诱导效率。microrna法也属于小分子法，目前通常以脂质体包裹后电转方式递送至细胞内，科学家们已通过研究证明此策略的可行性。其中有文献报道mir-291-3p、mir-294和mir-295被用来代替c-myc来产生同质的人类ipsc。此外，有研究表明mirna 302/367在不使用转录因子的情况下成功将小鼠和人类体细胞重编程为ipscs。目前已有报道的调控体细胞重编程的mirna家族主要包括mir-302/367家族、mir-200家族、mir-290/295家族、mir-34家族，此方法现有报道诱导效率为0.4-0.7%，但后续报道研究及应用报道较少，推测其原因micrna调控下游基因通常为一对多的复杂性，导致结果的不确定性和不稳定性。基于microrna法的低风险性以及已报到的大量技术可行性数据，其被公认为是针对未来临床应用产品最具前景的ips诱导技术，但目前提升此方法的诱导效率仍为攻坚难点。

6、综上所述，现有主流游离型质粒或病毒介导ips诱导技术存在的主要问题：（1）诱导过程繁琐，需要构建基因序列、制备病毒或质粒载体，同时增加了外源物质引入风险、全过程质控难点及成本，不利于技术未来产业化。（2）诱导技术的实现过程是间接，即先将基因导入细胞内，此过程无法控制每个细胞转染效率及程度的均一性，致使不同细胞中外源基因表达存在差异，进而影响这些转录因子与细胞基因组作用效果，最终导致得到的ips细胞株个体差异较大，增加了筛选成本及时间，看似诱导效率较高，但实际最终得到的优质目的细胞株较少。（3）诱导技术最致命的缺点还是对细胞有致畸可能性，致使未来临床使用存在风险隐患。此外，化学小分子介导的ips诱导技术现有的添加物组合诱导效率极低。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种基于microrna制备诱导性多能干细胞的方法。

2、为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明的第一方面，提供了一种制备诱导性多能干细胞的microrna组合物，包括mir-195-5p、mir-211-5p、mir-520c-3p、mir-30e-5p、mir-519d-3p、mir-32-5p中的至少一种。

4、在本发明的一些实施例中，所述microrna组合物中至少含有mir-195-5p、mir-211-5p、mir-520c-3p、mir-30e-5p、mir-519d-3p、mir-32-5p中的三种。

5、一种基于上述microrna组合物制备诱导性多能干细胞的方法，包括如下步骤：

6、s1：培养贴壁细胞；

7、s2：将microrna组合物转染至培养后的贴壁细胞；

8、s3：将持续转染后发生形变的克隆细胞团进行克隆挑取，传代培养，获得诱导性多能干细胞。

9、在本发明的一些实施例中，所述步骤s2中培养体系中microrna组合物的终浓度不超过200nm。

10、在本发明的一些实施例中，所述步骤s2中培养体系中每种microrna的物质的量均等。

11、在本发明的一些实施例中，所述步骤s2中的microrna组合物装载至脂质体或外泌体后进行转染。

12、在本发明的一些实施例中，所述步骤s2中的转染次数至少4次。

13、在本发明的一些实施例中，所述步骤s3中转染后的细胞传代三次以上得到诱导性多能干细胞。

14、在本发明的一些实施例中，所述步骤s3中转染后的细胞培养2-3天，细胞融合度达到60-70%进行重复传代。

15、在本发明的一些实施例中，所述贴壁细胞为间充质干细胞、血管内皮细胞或内皮祖细胞。

16、相对于现有技术，本发明具有以下优势：

17、（1）本发明克服了传统技术的安全性问题，完全不涉及基因编辑。

18、（2）本发明通过mirna小分子对细胞进行短时转录调节便达到重编程效果，细胞作用效果相对均一，筛选效率高。

19、（3）本发明的方法操作过程简单，外源物质引入极少，且成分简单，便于质控。

20、（4）本发明的方法与现有mirna诱导技术相比诱导率得到显著提升，与其他诱导技术联用会明显提升原有方法诱导效率。

技术特征：

1.一种制备诱导性多能干细胞的microrna组合物，其特征在于：包括mir-195-5p、mir-211-5p、mir-520c-3p、mir-30e-5p、mir-519d-3p、mir-32-5p中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的microrna组合物，其特征在于：所述microrna组合物中至少含有mir-195-5p、mir-211-5p、mir-520c-3p、mir-30e-5p、mir-519d-3p、mir-32-5p中的三种。

3.一种基于权利要求1-2任一所述的microrna组合物制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2中培养体系中microrna组合物的终浓度不超过200nm。

5.根据权利要求4所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2中培养体系中每种microrna的物质的量均等。

6.根据权利要求4所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2中的microrna组合物装载至脂质体或外泌体后进行转染。

7.根据权利要求3所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s2中的转染次数至少4次。

8.根据权利要求3所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s3中转染后的细胞传代三次以上得到诱导性多能干细胞。

9.根据权利要求7所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述步骤s3中转染后的细胞培养2-3天，细胞融合度达到60-70%进行重复传代。

10.根据权利要求4所述的制备诱导性多能干细胞的方法，其特征在于：所述贴壁细胞为间充质干细胞、血管内皮细胞或内皮祖细胞。

技术总结
本发明提供了一种基于microRNA制备诱导性多能干细胞的方法，其中使用的制备诱导性多能干细胞的microRNA组合物，包括miR‑195‑5p、miR‑211‑5p、miR‑520c‑3p、miR‑30e‑5p、miR‑519d‑3p、miR‑32‑5p中的至少一种。本发明的方法与现有miRNA诱导技术相比诱导率得到显著提升，与其他诱导技术联用会明显提升原有方法诱导效率。

技术研发人员：徐萌,曹宁,冀美超,张钰浩,张楠,刘可可,魏国清,陈英杰,田应洲
受保护的技术使用者：天九再生医学（天津）科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/11