一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法

本发明属于干细胞原代分离及培养，尤其涉及一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法。

背景技术：

1、干细胞是一类具有自我复制、自我更新、分化潜能的细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞，可从脂肪、骨髓、脐带、胎盘等多种成体组织中分离获得。牙周膜是连接牙骨质和牙槽骨之间的结缔组织，具有支持、感觉、营养等功能。近年的研究显示牙周膜中也存在未分化的间充质干细胞，间充质干细胞参与牙周组织的再生。

2、牙周病是一种以牙周结缔组织和牙槽骨不可逆的丧失为特征的疾病，是牙齿附着结构的慢性炎症，为成人失牙的最主要原因。在疾病早期，因机体的自然修复特性，牙周组织会出现一些少量的再生，而一旦疾病确立达到中晚期，如果没有积极治疗的介入，不仅自发的再生将不再出现，而且治疗后的再生也很罕见或很有限。目前，牙周支持组织重建主要依赖机械、药物和引导组织再生技术，随着分子生物学、组织工程学和干细胞技术的飞速发展，牙周组织再生工程技术成为牙周病治疗研究的热点。种子细胞作为组织工程技术的关键要素，一直是研究者们关注的热点。目前，已确认的可用于牙周组织工程技术的种子细胞有胚胎干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞和牙周膜干细胞等。目前牙周组织工程的种子细胞多选用干细胞，其来源多为健康的人体组织，通常存在取材有创、来源有限等弊端，在一定程度上限制了其应用于临床治疗的可行性。鉴于牙周膜干细胞是牙周组织再生工程的关键种子细胞之一，所以扩大牙周膜干细胞的获取来源是十分有必要的，但是由于在直接从炎性牙周膜组织中分离获得炎性牙周膜干细胞的过程中，炎性牙周膜干细胞极易被污染进而导致最终无法获得炎性牙周膜干细胞，所以本领域获取炎性牙周膜干细胞的常规方式均为采用炎性诱导因子将正常牙周膜干细胞诱导为炎性牙周膜干细胞，并未有如何从炎性牙周膜组织中分离获得炎性牙周膜干细胞的有关研究。因此，如何扩大牙周膜干细胞的获取来源以及如何在扩大获取来源的基础上又能通过一种通用的方法将牙周膜干细胞或者炎性牙周膜干细胞从牙周膜组织或炎性牙周膜组织中有效地分离出来，是极其重要的。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种同时适用于正常牙周膜干细胞(hpdlscs)和炎性牙周膜干细胞(i-hpdlscs)的牙周膜干细胞原代分离及培养方法，具有成本低、所需时间短的优势。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

3、本发明提供了一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法，包括如下步骤：将牙周膜组织置于第一α-mem培养液中清洗，将清洗后牙周膜组织与混合酶液混合消化，得到酶解后的牙周膜及其组织；将酶解后的牙周膜及其组织与第二α-mem培养液混合培养，当牙周膜细胞生长汇合达到80％时，用质量体积浓度0.25％胰酶消化，离心收集细胞，将收集的细胞与第二α-mem培养液混合，去除未消化完全的组织块，离心弃上清液，得牙周膜细胞；将得到的牙周膜细胞与第二α-mem培养液混合进行牙周膜细胞原代培养，采用有限稀释法克隆分离获得牙周膜干细胞；

4、所述第一α-mem培养液为含有胎牛血清、两性霉素b、l-谷氨酰胺、氨苄青霉素、庆大霉素的α-mem培养液；

5、所述混合酶液由ⅰ型胶原酶和dispase酶组成；

6、所述第二α-mem培养液为含有胎牛血清、氨苄青霉素和庆大霉素的α-mem培养液。

7、优选的，所述牙周膜组织包括正常牙周膜组织和炎性牙周膜组织。

8、优选的，所述第一α-mem培养液为含有10％胎牛血清、2.5μg/ml两性霉素b、2mml-谷氨酰胺、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml庆大霉素的α-mem培养液。

9、优选的，所述第二α-mem培养液为含有10％胎牛血清、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml庆大霉素的α-mem培养液。

10、优选的，所述混合酶液由3mg/ml的ⅰ型胶原酶和4mg/ml的dispase酶按照1：1体积比混合所得。

11、优选的，将清洗后牙周膜组织与混合酶液混合消化的步骤为：在37℃，5％co2条件下100rpm/min旋转消化30min-60min。

12、优选的，获得牙周膜组织的方法为：采用含10％胎牛血清、100μg/ml氨苄青霉素25μg/ml庆大霉素的pbs反复冲洗牙周膜，然后刮取牙周膜根面组织。

13、优选的，采用有限稀释法克隆分离获得牙周膜干细胞的方法包括如下步骤：取对数生长的第1代牙周膜细胞，稀释为10-15个/ml的单细胞悬液，接种至细胞培养板中，每孔加入所述第二α-mem培养液，保证每个孔不多于1个细胞，待培养至细胞贴壁后挑出单个细胞孔并标记，补加所述第二α-mem培养液，每隔2-3d换液，当孔内细胞形成克隆集落并长至孔底1/2后，用质量体积浓度0.25％胰酶消化并扩大培养，即得到牙周膜干细胞。

14、本发明的有益效果：

15、本发明的方法既能用于健康牙周膜干细胞的原代分离和培养，又能用于炎性牙周膜干细胞的原代分离和培养，克服了牙周组织工程的种子细胞取材来源有限以及有创的弊端。另外，本发明方法还具有降低了成本，缩短了分离培养时间的优势。

技术特征：

1.一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法，其特征在于，包括如下步骤：将牙周膜组织置于第一α-mem培养液中清洗，将清洗后牙周膜组织与混合酶液混合消化，得到酶解后的牙周膜及其组织；将酶解后的牙周膜及其组织与第二α-mem培养液混合培养，当牙周膜细胞生长汇合达到80％时，用质量体积浓度0.25％胰酶消化，离心收集细胞，将收集的细胞与第二α-mem培养液混合，去除未消化完全的组织块，离心弃上清液，得牙周膜细胞；将得到的牙周膜细胞与第二α-mem培养液混合进行牙周膜细胞原代培养，采用有限稀释法克隆分离获得牙周膜干细胞；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牙周膜组织包括正常牙周膜组织和炎性牙周膜组织。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一α-mem培养液为含有10％胎牛血清、2.5μg/ml两性霉素b、2mml-谷氨酰胺、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml庆大霉素的α-mem培养液。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二α-mem培养液为含有10％胎牛血清、100μg/ml氨苄青霉素、25μg/ml庆大霉素的α-mem培养液。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合酶液由3mg/ml的ⅰ型胶原酶和4mg/ml的dispase酶按照1：1体积比混合所得。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将清洗后牙周膜组织与混合酶液混合消化的步骤为：在37℃，5％co2条件下100rpm/min旋转消化30min-60min。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得牙周膜组织的方法为：采用含10％胎牛血清、100μg/ml氨苄青霉素25μg/ml庆大霉素的pbs反复冲洗牙周膜，然后刮取牙周膜根面组织。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用有限稀释法克隆分离获得牙周膜干细胞的方法包括如下步骤：取对数生长的第1代牙周膜细胞，稀释为10-15个/ml的单细胞悬液，接种至细胞培养板中，每孔加入所述第二α-mem培养液，保证每个孔不多于1个细胞，待培养至细胞贴壁后挑出单个细胞孔并标记，补加所述第二α-mem培养液，每隔2-3d换液，当孔内细胞形成克隆集落并长至孔底1/2后，用质量体积浓度0.25％胰酶消化并扩大培养，即得到牙周膜干细胞。

技术总结
本发明提供了一种牙周膜干细胞原代分离及培养方法，属于干细胞原代分离及培养技术领域。本发明提供的牙周膜干细胞原代分离及培养方法既能用于健康牙周膜干细胞的原代分离和培养，又能用于炎性牙周膜干细胞的原代分离和培养，克服了牙周组织工程的种子细胞取材来源有限以及有创的弊端。另外，本发明方法还具有降低了成本，缩短了分离培养时间的优势。

技术研发人员：林永盛,周建业,郑欣
受保护的技术使用者：西北民族大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13