检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物与试剂盒及方法与流程

本发明涉及艰难梭菌检测，具体是指检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物与试剂盒及方法。

背景技术：

1、艰难梭菌(clostridiumdifficile，cd)是一种具有芽胞结构的革兰氏阳性严格厌氧杆菌，是全球范围内公认的医院内感染与抗生素性腹泻最为重要的病原微生物。它能够引起抗生素相关性腹泻、结肠炎、致死性伪膜性肠炎等。2013年，艰难梭菌被美国国家卫生部列为抗生素相关耐药菌三大病原菌之首，威胁程度指定为“最紧急”。由于培养分离条件严格苛刻，相关研究报道仍然较少。2015年2月份发表在《新英格兰医学杂志》的最新文章《美国艰难梭菌感染的负担》显示，在美国每年感染患者超过50万人，死亡人数超过2.9万，平均病死率为5.5-6.9％重症死亡率在60％以上，每年用于治疗的医疗费用在100亿美金以上。在中国，抗生素滥用严重，据最新报道艰难梭菌感染占院内腹泻中患者人数25％以上，抗生素相关腹泻中20-30％；肿瘤放疗患者中感染患者在30％以上。艰难梭菌感染易出现抗生素耐药、反复复发、传染性、高致死性；在全球范围内，艰难梭菌早己成为医院感染与抗生素耐药领域臭名昭著的“超级臭虫”。

2、长期以来一直认为艰难梭菌是一种不能引起严重感染后果的病原微生物，然而最近十年艰难梭菌感染流行范围、发生率、致死率、复发性等感染特点发生颠覆性变化。自2002年以来，加拿大、美国以及欧洲一些国家相继发生100多次出现艰难梭菌爆发流行，流行期间死亡率迅速上升。研宄表明这主要归因于新的艰难梭菌高毒力菌株的出现。在中国，因艰难梭菌导致的腹泻从5年前的占院内腹泻的0.05％直线上升到最近的28％，院内获得性艰难梭菌感染从1.3/1000上升到11.6/1000，院感人数上升近十倍。

3、bl/nap1/027菌株为美国、加拿大等国家艰难梭菌流行爆发的驱动菌株，它拥有以往菌株没有的特点，bl/nap1/027含有tcdc基因117位点缺失引起tcdc基因发生移码突变，导致tcdc基因翻译提前终止，产生严重截断的65氨基酸残基；tcdc为艰难梭菌a毒素(tcda)与b毒素(tcdb)的抑制基因，tcdc突变体菌株较之传统菌株，导致产生16倍以上毒素a和产生23倍以上毒素b，引起喹诺酮类药物耐药；此外bl/napi/027菌株也产生二元毒素cdta或cdtb，因此，我们提出检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物与试剂盒及方法来解决以上问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是克服以上技术问题，提供一种检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物与试剂盒及方法，通过检测tcdc基因突变并配合艰难梭菌毒力基因检测包括tcdb、二元毒力基因cdta/b，从而确定高毒艰难梭菌感染并检测毒力基因类型。

2、为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物，包括以下引物探针：

3、tpi引物探针：

4、f：5`-ctagctaaactagctccacctac-3`；

5、r：5`-tgcaactgctgaagatgctaatg-3`；

6、p：5`-agctccatctatatcactttgaccca-3`；

7、tcdb引物探针：

8、f：5`-agcaatgaaagttcaagtttatgct-3`；

9、r：5`-gctgcacctaaacttacaccatctat-3`；

10、p：5`-actattacagatgcagccaaagttgttgaatt-3`；

11、tcdc引物探针：

12、f：5`-ttgctctactggcatttattttgg-3`；

13、r：5`-accatggttcagcatcagacaa-3`；

14、p：5`-cctcaccagcttgttctgaagaccatgag-3`；

15、tcdc117位点缺失引物探针：

16、f：5`-ttgctctactggcatttattttagg-3`；

17、r：5`-accatggttcagcatcagacaa-3`；

18、p：5`-cctcaccagcttgttctgaagaccatgag-3`；

19、cdta引物探针：

20、f：5`-gggaaggacaagcactgtctta-3`；

21、r：5`-gataagctccaggagaaccttt-3`；

22、p：5`-ctagtattggtagtgtgaatatgagtgcatttg-3`；

23、cdtb引物探针：

24、f：5`-acaatttctttgacccaagg-3`；

25、r：5`-tttcttatagccttgttctgcaaa-3`；

26、p：5`-tctgattgggaagacgaagatttggataca-3`。

27、作为改进，上述探针选用下述任一荧光标记物在其5'端标记：fam、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texas red、red670、ned，选用下述任一淬灭剂在其3'端标记：6-tam、bhq-i和结合分子沟的非荧光光淬灭剂。

28、检测艰难梭菌毒力和毒素类型的试剂盒，包含所述的组合物中的一种或多种和下述标准品中的一种或多种：tpi标准品、tcdb标准品、tcdc标准品、tcdc117位点缺失标准品、cdta标准品和cdtb标准品。

29、检测艰难梭菌毒力和毒素类型的方法，包括如下步骤：在检测体系中加入待检样本dna、所检测基因对应的引物和探针、pcr反应试剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量pcr的结果分析艰难梭菌高毒菌株与毒力类型。

30、采用以上方法后，本发明具有如下优点：

31、一、本发明中检测的tpi基因为艰难梭菌特异性保守基因，对tpi基因的检测可以准确检测到艰难梭菌是否存在；

32、二、本发明中检测的tcdb毒力基因，有益于辨别艰难梭菌是否为致病菌株；

33、三、本发明中检测的cdta或cdtb基因用来判断艰难梭菌的毒性程度，二元毒素cdta、cdtb基因可独立致病或增强tcdb毒素的毒力；

34、四、本发明中实时定量pcr检测的tcdc 117位点缺失以判断高毒艰难梭菌。

技术特征：

1.检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物，其特征在于：包括以下引物探针：

2.根据权利要求1所述的检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物，其特征在于：上述探针选用下述任一荧光标记物在其5'端标记：fam、vic、tet、joe、hex、cy3、cy5、rox、red610、texasred、red670、ned，选用下述任一淬灭剂在其3'端标记：6-tam、bhq-i和结合分子沟的非荧光光淬灭剂。

3.检测艰难梭菌毒力和毒素类型的试剂盒，其特征在于：包含权利要求1所述的组合物中的一种或多种和下述标准品中的一种或多种：tpi标准品、tcdb标准品、tcdc标准品、tcdc117位点缺失标准品、cdta标准品和cdtb标准品。

4.检测艰难梭菌毒力和毒素类型的方法，其特征在于：包括如下步骤：在检测体系中加入待检样本dna、所检测基因对应的引物和探针、pcr反应试剂进行扩增，同时设阳性对照、阴性对照，通过荧光定量pcr的结果分析艰难梭菌高毒菌株与毒力类型。

技术总结
本发明公开了检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物与试剂盒及方法，涉及艰难梭菌检测技术领域。检测艰难梭菌毒力和毒素类型的组合物，包括以下引物探针：TPI引物探针、TcdB引物探针、Tcdc引物探针、Tcdc117位点缺失引物探针、CdtA引物探针和CdtB引物探针；检测艰难梭菌毒力和毒素类型的试剂盒，包含以下标准品：TPI标准品、TcdB标准品、Tcdc标准品、Tcdc117位点缺失标准品、CdtA标准品和CdtB标准品；检测艰难梭菌毒力和毒素类型的方法，包括如下步骤：在检测体系中加入待检样本DNA、所检测基因对应的引物和探针、PCR反应试剂进行扩增，分析艰难梭菌高毒菌株与毒力类型。本发明通过检测tcdC基因突变并配合艰难梭菌毒力基因检测，从而确定高毒艰难梭菌感染并检测毒力基因类型。

技术研发人员：盖冬玮,冷雪娇
受保护的技术使用者：青岛万物新生生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13