一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用的制作方法

本发明涉及酶工程，具体涉及一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用。

背景技术：

1、γ-氨基丁酸(gaba)是一种非蛋白天然氨基酸，具有降血压、利尿、改善睡眠、抗抑郁等多种重要的生理功能，在医药、食品及化妆品等领域应用前景广阔。生物法合成gaba不受资源、环境和空间等限制，是研究的一个主要方向。谷氨酸脱羧酶(glutamic aciddecarboxylase,gad；ec 4.1.1.15)是生物法合成gaba的关键限速酶，其能够专一、不可逆地催化l-谷氨酸(或l-谷氨酸盐)脱去α-羧基生成gaba并释放出co2。获取具有良好催化性能的谷氨酸脱羧酶是实现生物法高效合成gaba的重要前提。

2、目前，来源于乳酸乳球菌、嗜热链球菌、屎肠球菌、植物乳杆菌、短促生乳杆菌、清酒乳杆菌、保加利亚乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、布氏乳杆菌、大肠杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌、巨大芽孢杆菌、米曲霉、绿色木霉及少孢根霉等不同微生物染色体上的gad基因已被克隆和异源表达，但随后的酶学性质研究显示，天然的gad普遍存在热稳定性差和催化活性低的缺陷。为此，包括国内外研究者通过拉氏图信息、脯氨酸效应、蛋白质表面电荷优化、结构域增减、序列一致性等方法在一定程度上提升了gad的催化性能，但生物法合成gaba在工业应用中，仍受到谷氨酸脱羧酶热稳定性差、以及活性与热稳定性不兼容等问题的制约。

3、近年来，来源于大肠杆菌(pdb ids.1xey,3fz6,3fz7,3fz8,2dgk,1pmo)与短促生乳杆菌(原短乳杆菌，pdb id.5gp4)的微生物源gad晶体结构模型先后被解析，这为gad的“结构-功能”关系提供了重要的信息。如何在提升谷氨酸脱羧酶热稳定性的同时、强化其对底物的亲和力并进一步提高其催化活性，具有重要的研究意义和价值。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的上述技术问题，本发明提供一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。

2、本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为seq idno.4。

3、优选的，氨基酸序列的获取方法包括：

4、获取短促生乳杆菌谷氨酸脱羧酶的野生型氨基酸序列；

5、固定野生型氨基酸序列的多个位点；

6、基于祖先酶序列重建方法，构建所述野生型氨基酸序列的祖先酶进化树；

7、根据所述祖先酶进行树，获得所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列。

8、优选的，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：

9、f65,k89,c130,g164,q166,w169,i178,m185,i211,t215,d246,a248,t254,l267,h278,k279和p285。

10、优选的，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：根据所述氨基酸序列，获得相应的基因序列；合成并扩增所述基因序列；根据所述基因序列以及表达载体，构建重组质粒；根据所述重组质粒以及宿主，构建工程菌或工程细胞；利用工程菌或工程细胞表达重组蛋白；从表达重组蛋白的工程菌或工程细胞中分离纯化谷氨酸脱羧酶。

11、优选的，构建工程菌的方法包括：

12、设计第一引物对和第二引物对，其中第一引物对为：gadb1413-f1和gadb1413-r1，第二引物对为gadb1413-f2和gadb1413-r2；

13、分别以第一引物对和第二引物对，扩增所述基因序列，获得第一序列和第二序列；

14、利用限制性内切酶nde i和sal i分别处理载体pet28a和纯化后的第一序列，获得双酶切pet28a和双酶切第一序列；通过t4-dna连接酶，连接所述双酶切pet28a和双酶切第一序列，获得第一质粒；将所述第一质粒导入e.coli bl21(de3)感受态细胞中，获得第一工程菌；

15、利用限制性内切酶nco i和kpn i分别处理载体pnz8149和纯化后的第二序列，获得双酶切pnz8149和双酶切第二序列；通过t4-dna连接酶，连接所述双酶切pnz8149和双酶切第二序列，获得第二质粒；将所述第二质粒导入l.lactis nz3900感受态细胞中，获得第二工程菌。

16、优选的，所述谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为55℃，最适反应ph为ph5.0，t5015为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物l-谷氨酸的米氏常数为26.80mm，催化效率为2.14s-1mm-1。

17、本发明还提供上述谷氨酸脱羧酶的基因序列。优选的，所述基因为seq idno.2。

18、本发明还提供一种上述谷氨酸脱羧酶的应用，用于催化l-谷氨酸或l-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。

19、优选的，基于谷氨酸脱羧酶突的氨基酸序列构建的工程菌经诱导表达后，用于催化l-谷氨酸或l-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。

技术特征：

1.一种谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为seq id no.4。

2.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，氨基酸序列的获取方法包括：

3.根据权利要求2所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述位点包括以下氨基酸位点的组合：

4.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，谷氨酸脱羧酶的制备方法包括：

5.根据权利要求4所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，构建工程菌的方法包括：

6.根据权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶，其特征在于，所述谷氨酸脱羧酶的最适反应温度为55℃，最适反应ph为ph 5.0，t5015为59.1℃，60℃条件下的半衰期t1/2为25.6分钟，对底物l-谷氨酸的米氏常数为26.80mm，催化效率为2.14s-1mm-1。

7.一种谷氨酸脱羧酶的基因序列，其特征在于，所述基因序列用于表达如权利要求1所述的谷氨酸脱羧酶。

8.根据权利要求7述的基因序列，其特征在于，所述基因序列为seq idno.2。

9.一种如权利要求1-6任一项所述谷氨酸脱羧酶的应用，其特征在于，用于催化l-谷氨酸或l-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，基于谷氨酸脱羧酶突的氨基酸序列构建的工程菌经诱导表达后，用于催化l-谷氨酸或l-谷氨酸盐脱去α-羧基生成γ-氨基丁酸。

技术总结
本发明公开了一种谷氨酸脱羧酶及其基因和应用，谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4，为一种谷氨酸脱羧酶突变体。谷氨酸脱羧酶突变体的最适反应温度为55℃，最适反应pH为pH 5.0，T<subgt;50</subgt;<supgt;15</supgt;为59.1℃，60℃条件下的半衰期t<subgt;1/2</subgt;为25.6分钟，对底物L‑谷氨酸的米氏常数为26.80mM，催化效率为2.14s<supgt;‑1</supgt;mM<supgt;‑1</supgt;；具有良好的热稳定性、底物亲和力和催化活性。

技术研发人员：王东阳,孔建彪,戈连峰,吕常江,陈正
受保护的技术使用者：山东阳成生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13