一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法与流程

本发明涉及烟草，特别涉及一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法。

背景技术：

1、基因突变是形成优良性状的分子基础。近年来基于crispr/cas9的基因组编辑系统得到了迅速发展，并广泛应用于各种生物体和细胞系的靶向突变,其操作简单，突变高效。除了基因敲除，基于crispr/cas9的系统诱导的突变还包括碱基替换，可通过引导编辑(prime editing,pe)技术实现。

2、pe基因编辑技术是crispr基因编辑技术的一种重要更新，可以实现a、t、c、g四种碱基所有12种转换突变，从而将新的遗传信息写入到dna特定的位置。2019年该技术在人类细胞中首次报道使用pe后，pe在一些单子叶植物中迅速发展，如水稻、小麦和玉米。不过，pe系统在双子叶植物中的报道十分有限，尤其是对于稳定转基因植物。目前大多数双子叶植株的pe技术测试是利用瞬时转化系统，包括拟南芥、烟草、花生、鹰嘴豆和豇豆等；适用于烟草的稳定转化且可遗传的pe技术还未有报道和应用。

3、冷杉醇(z-abienol)是一种赖百当二萜化合物，由烟草腺毛合成并分泌到叶片表面，其降解后产生令人愉悦的龙涎香香气物质，是烟草制香成分的重要物质组成。不过，冷杉醇一般只在香料烟等少数烟草品种中产生，主栽品种如烤烟、白肋烟等都不能合成该物质。王国平等人在香料烟中克隆了冷杉醇合成的2个关键酶全长基因，ntcps2和ntabs，通过转基因整合到烤烟品种红花大金元中，但没有检测到冷杉醇合成。因此，至今还未有对ntcps2基因292位碱基进行原位编辑创制高含量冷杉醇烟草的报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，首先通过体外表达和纯化ntcps2蛋白“292t”和“292g”两种变异型，分别催化合成冷杉醇合成的第一步反应：以ggpp为底物合成8-oh-cpp，证明烤烟中292位碱基t的突变是导致烤烟不能合成冷杉醇的原因；其次，构建了pe-nt4编辑载体，其构成包括：pegrna、nesgrna、融合蛋白、紫色筛选标记基因pap1以及nptii抗性筛选基因，所述融合蛋白为逆转录酶mmlv、单链核酸酶cas9n和hpt组成的融合蛋白；所述cas9n为cas9 h840a突变体。其元件表达框如下：为atu6-trna-nesgrna-trna-pegrna-ployt||2x35s-mmlv_cas9n_hpt-ext||atubi-pap1-nos||entcup2-nptii-nos||，序列如seq id no.3所示。利用pe-nt4编辑系统成功将烟草ntcps2基因292位的碱基t突变为碱基g，在烤烟栽培品种红花大金元中创制了高含量冷杉醇的烤烟品系。

2、本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

3、一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，包括以下步骤：

4、(1)载体构建：合成引导编辑系统的表达框并连接至pore骨架载体中，形成pore-pe-nt4重组载体；

5、(2)遗传转化及素材创制：将构建好的载体转入农杆菌，筛选获得阳性单克隆，经液体培养基过夜培养后，吸取200μl至固体平板中，28℃过夜培养形成菌苔备用，转化烟草品种，获得冷杉醇合成关键基因ntcps2第292位碱基t突变为g的烟草。

6、优选地，所述引导编辑系统包括：pegrna、nesgrna、融合蛋白、紫色筛选标记基因pap1以及nptii抗性筛选基因，所述融合蛋白为逆转录酶mmlv、单链核酸酶cas9n和hpt组成的融合蛋白；所述cas9n为cas9h840a突变体。

7、优选地，所述pegrna包括逆转录模板以及引物结合位点，所述pegrna的靶向位点序列为agcagaacaatacagatgaaagg；所述pegrna的逆转录模板和引物结合位点序列为：ttctgtcaagcccttcatctgtattgttctg，逆转录模板包含1处回复突变：第3位碱基t突变为g，能使野生型taa终止密码突变为gaa谷氨酸；所述nesgrna靶向位点序列为ggaaacccaagctgtgtcatagg。

8、优选地，所述pore-pe-nt4重组载体序列如seq id no.3所示。

9、一种高含量冷杉醇烟草，所述高含量冷杉醇烟草是通过上述方法创制得到的，相比现有烤烟品种，冷杉醇含量提升32％。

10、一种载体，所述载体包含转录pegrna的dna分子。

11、优选地，所述载体包含转录融合蛋白的编码基因的表达盒。

12、一种载体在基因编辑中的应用。

13、本发明上述技术方案，具有如下有益效果：

14、(1)周期短，与传统杂交育种或分子标记育种(一般需要5-10年)相比，pe技术方案可在12个月左右获得纯合体。

15、(2)产量高，与传统育种获得的品种大白筋599相比，经pe技术方案获得的纯合体烟草冷杉醇含量可提升32％。

16、(3)不增加负面表型，pe技术方案不导入其他与ntcps2基因连锁的负面表型dna片段，因此不会带来负面表型。

技术特征：

1.一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，其特征在于，所述引导编辑系统包括：pegrna、nesgrna、融合蛋白、紫色筛选标记基因pap1以及nptii抗性筛选基因，所述融合蛋白为逆转录酶mmlv、单链核酸酶cas9n和hpt组成的融合蛋白；所述cas9n为cas9 h840a突变体。

3.根据权利要求2所述的利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，其特征在于，所述pegrna包括逆转录模板以及引物结合位点，所述pegrna的靶向位点序列为agcagaacaatacagatgaaagg；所述pegrna的逆转录模板和引物结合位点序列为：ttctgtcaagcccttcatctgtattgttctg，逆转录模板包含1处回复突变：第3位碱基t突变为g，能使野生型taa终止密码突变为gaa谷氨酸；所述nesgrna靶向位点序列为ggaaacccaagctgtgtcatagg。

4.根据权利要求1所述的利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，其特征在于，所述pore-pe-nt4重组载体序列如seq id no.3所示。

5.一种高含量冷杉醇烟草，其特征在于，所述高含量冷杉醇烟草是通过权利要求1-4任一所述方法创制得到的，相比现有烤烟品种，冷杉醇含量提升32％。

6.一种载体，其特征在于，所述载体包含转录权利要求2-3任一所述的pegrna的dna分子。

7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述载体包含转录权利要求2-3任一所述的融合蛋白的编码基因的表达盒。

8.根据权利要求6-7任一所述的载体在基因编辑中的应用。

技术总结
本发明公开了一种利用引导编辑系统创制高含量冷杉醇烟草的方法，包括以下步骤：(1)载体构建：合成引导编辑系统的表达框并连接至pORE骨架载体中，形成pORE‑PE‑Nt4重组载体；(2)遗传转化：将构建好的载体转入农杆菌，筛选获得阳性单克隆，经液体培养基过夜培养后，吸取至固体平板中，28℃过夜培养形成菌苔备用，转化烟草品种，获得高含量冷杉醇烟草。本申请通过优化的PE技术将烟草NtCPS2基因292位的碱基T突变为碱基G，成功创制了烟草栽培品系；PE技术方案可在12个月左右获得纯合体；相比现有烤烟品种大白筋599，经引导编辑创制的红花大金元烤烟品种纯合体冷杉醇含量可提升32％；PE技术方案不导入其他与NtCPS2基因连锁的负面表型DNA片段，不会带来负面表型。

技术研发人员：张建铎,杨光宇,孔维松,师建全,王晋,肖冬,邓乐乐,杨文武,许力,蒋佳芮,高茜,向海英,曾婉俐
受保护的技术使用者：云南中烟工业有限责任公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13