一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法与流程

本发明涉及一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，属于分子生物学检测领域。

背景技术：

1、血液作为临床上常见的一种检测样本，在基因疾病诊断以及治疗上的作用不可小觑。从血液中获得宿主的核酸是目前临床以及科研中最为常见的一种手段。其中，核酸的浓度以及纯度对于下游众多检验的准确性和可靠性至关重要。

2、目前核酸提取的方法有最初的溶液法、抽提法和柱式法，及近些年广泛流行的磁珠法等其他方法。磁珠法的核酸提取优化与传统方法比较，最主要的优势主要表现在三个方面。第一：高通量、自动化。可以同时匹配多通道提取仪器，多个样本同时进行提取，减少手动操作中的误差以及样本的挥发和降解；第二，耗时少，操作简单。大多数提取耗时均在1h以内，便可获得多样本核酸，操作简单，无需多步骤操作；第三：利用磁珠与目的核酸的特异性结合，获得的核酸纯度高、浓度好。

3、目前市面上大多数的核酸提取均离不开醇类试剂，其作为一种重要的核酸助沉剂，它的作用是无法完全替代的。但作为有机溶剂，乙醇和异丙醇都具有一定的毒性，长期使用会对人体产生一定的危害，且均属于易燃、易爆、易挥发的试剂。故使用无醇的试剂替代已是大势所趋，是维护生物安全重中之重。

4、鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了提供一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，将无醇试剂与磁珠相结合并应用于核酸提取，去除醇类试剂，提取操作过程更加简洁和安全。

2、在本发明的第一方面，提供了一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒。

3、所述的试剂盒，包括蛋白酶k、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液；

4、所述蛋白酶k的浓度为20mg/ml；

5、所述裂解液为buffer ml，含100～500mm tris-hcl(三羟甲基氨基甲烷)，0.5-1mmedta(乙二胺四乙酸)，3～6m的盐酸胍，2～5％triton x-100，0.05％-0.1％sds(十二烷基硫酸钠)，0.2m-0.35m山梨醇和3-10％tween-20，ph为6.5～8.5；进一步地，所述裂解液含0.5mtris-hcl(三羟甲基氨基甲烷)，1mm edta(乙二胺四乙酸)，0.3m山梨醇，4m的盐酸胍，3％triton x-100，3％tween-20，0.1％sds，ph为7.5。

6、所述磁珠悬浮液中的磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/ml，ph为5.0；

7、所述漂洗液1为buffer pw1，含有：10％-30％ peg-8000，1-2m盐酸胍，ph7-8的20-50mm tris-hcl和2-5m nacl；进一步地，所述漂洗液1含30％peg-8000，1m盐酸胍，ph7.5的30mm tris-hcl和3m nacl。

8、所述漂洗液2为buffer pw2，含有：10％-20％ peg-8000，ph7-8的20-50mm tris-hcl和2-5m nacl；进一步地，所述漂洗液2含20％peg-8000，ph7.5的20mm tris-hcl和2mnacl。

9、所述洗脱液为buffer be，含1～50mm tris-hcl和1～10mm edta，ph为7.5～9.0。进一步地，所述洗脱液含5mm tris-hcl和2mm edta，ph为8.0。

10、在本发明的第二方面，提供了如第一方面所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，所述方法配合核酸提取仪使用，包括如下步骤：

11、1)将新鲜放置涡旋振荡仪上震荡混匀10秒后，取300ul血液；

12、2)按照下表向深孔板内添加试剂：

13、

14、3)将加入试剂的深孔板和磁套按照下列顺序放于cwe3200仪器上；

15、4)运行相应提取程序，约20分钟后结束。

16、在本发明的第三方面，提供了如第一方面所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，所述方法为手动提取，包括如下步骤：

17、1)取300μl血液样本放置1.5ml离心管中，再加入200μl裂解液、20μl蛋白酶k和20μl磁珠悬浮液，涡旋震荡混匀；

18、2)将水浴锅或恒温混匀仪预热至65℃，震荡幅度1700rpm，孵育20分钟；

19、3)将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；

20、4)加入500μl漂洗液1，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液；

21、5)加入500μl漂洗液2，涡旋震荡混匀后，将离心管固定于磁力架上静置1分钟，之后弃去溶液.重复一次；

22、6)离心管短暂离心后，将其重新固定于磁力架上用移液器去除管底溶液，向离心管中加入80μl洗脱液后涡旋震荡使磁珠充分悬浮于洗脱液中，之后将离心管固定于56℃、1600rpm的恒温混匀上震荡洗脱10分钟；

23、7)将离心管固定于磁力架上静置2分钟，所得上清即为核酸提取产物，转移至离心管中-20℃保存备用。

24、本发明具有如下技术效果：

25、1)目前针对磁珠法血液样本的核酸提取，大致分为裂解、结合、漂洗、洗脱四个步骤。目前在结合这一步骤，现有技术均采用醇类，进行结合助沉核酸，如乙醇或异丙醇。同时需要匹配机器进行自动化提取的话，在这一步需暂停仪器，人工加入醇类试剂。操作复杂繁琐，不便捷。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，在提取时，无需暂停机器加入异丙醇，即可完成核酸与磁珠的结合，省时省力。同时自动化漂洗无需干燥等待，最快20分钟内即可获得高质量的核酸。

26、2)本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，对裂解液和漂洗液进行了改进，均无需加入乙醇或异丙醇。且实施例4表6的数据显示：本发明提取试剂盒的平均ct值相比现有技术(cn202110831513.7)低2个ct值，回收效率要高于现有技术(cn202110831513.7)4倍左右。

技术特征：

1.一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒，包括蛋白酶k、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液；

2.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶k的浓度为20mg/ml。

3.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液含0.5m tris-hcl，1mm edta，0.3m山梨醇，4m的盐酸胍，3％triton x-100，3％tween-20，0.1％sds，ph为7.5。

4.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠悬浮液中的磁珠为超顺磁微球，粒径介于10～50nm，悬浮液浓度为100mg/ml，ph为5.0。

5.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液1含30％peg-8000，1m盐酸胍，ph7.5的30mm tris-hcl和3m nacl。

6.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液2含20％peg-8000，ph7.5的20mm tris-hcl和2m nacl。

7.根据权利要求1所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱液含5mm tris-hcl和2mm edta，ph为8.0。

8.如权利要求1-7任意一项所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法配合核酸提取仪使用，包括如下步骤：

9.如权利要求1-7任意一项所述的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法为手动提取，包括如下步骤：

技术总结
本发明涉及一种基于磁珠法血液无醇提取试剂盒及使用方法，属于分子生物学检测领域。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，包括蛋白酶K、裂解液、磁珠悬浮液、漂洗液1、漂洗液2和洗脱液。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，在提取时，无需暂停机器加入异丙醇，即可完成核酸与磁珠的结合，省时省力。同时自动化漂洗无需干燥等待，最快20分钟内即可获得高质量的核酸。本发明的基于磁珠法血液无醇提取试剂盒，对裂解液和漂洗液进行了改进，均无需加入乙醇或异丙醇。且实施例4表6的数据显示：本发明提取试剂盒的平均Ct值相比现有技术(CN202110831513.7)低2个Ct值，回收效率要高于现有技术(CN202110831513.7)4倍左右。

技术研发人员：孔铭,殷剑峰,王春香
受保护的技术使用者：江苏康为世纪生物科技股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13