一种铜敏感型恶臭假单胞菌基因敲除突变株及其应用

本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种铜敏感型恶臭假单胞菌基因敲除突变株及其应用。

背景技术：

1、铜是人类最早使用的金属之一，具有延展性好、导热性好和电导率高等优点，广泛应用于电缆、电器和电子元器件等，也可作为原料与其他金属组成各种性能优越的合金材料。此外，铜的化合物还被用于纺织品媒染剂、水池消毒剂和农业杀菌剂(如波尔多液)等产品。铜的广泛使用也导致了大量含铜废水的产生，主要包括冶炼废水、印制电路板蚀刻废水和电镀废水等。铜超标废水的排放对水体和土壤都具有较大的危害。

2、随着工业的高速发展，许多地区的生态环境遭到破坏，重金属污染物是其中重要的因素之一，环境中主要的重金属污染物包括汞、镉、铅、铬以及类金属砷等。铜也属于重金属，但由于其生物毒性相对较低，受关注程度不如上述高度毒性的重金属，但是，当环境铜离子浓度超出微生物的耐受范围时，对环境微生物生态将产生较大影响。铜离子可破坏微生物细胞壁进入细胞后可影响许多酶的活性，造成代谢混乱，从而表现出抑菌活性。环境中的微生物为抵抗重金属胁迫，进化出完善的响应和抗性机制，利用筛选或改造的微生物对重金属离子进行吸附和固化是治理水体和土壤的重金属污染问题的有效途径。此外，利用改造的微生物指示环境中重金属污染问题也是环境监测中的一种重要手段。开发更高效的微生物工具，将有利于提高微生物对环境重金属污染的修复和监测。

技术实现思路

1、本发明针对恶臭假单胞菌对cu2+有较强的抗性，提出了一种无标记基因敲除突变株，从而提高其在监测环境cu2+污染方面的应用潜力。

2、本发明的第一个目的是提供一种对cu2+敏感的恶臭假单胞菌双基因簇敲除突变株，是将恶臭假单胞菌中编码双组分系统的coprs1基因簇(序列如seq id no.1所示，包含基因copr1与cops1)和coprs2基因簇(序列如seq id no.2所示，包含基因copr2与cops2)敲除。

3、具体的，所述的突变株是将恶臭假单胞菌中的coprs1基因簇从第147位到第1761位之间的编码序列以及coprs2基因簇从第185位到第1852位之间的编码序列进行无痕敲除。

4、所述的恶臭假单胞菌是恶臭假单胞菌kt2440(atcc 47054)。

5、本发明的第二个目的是提供了一种恶臭假单胞菌coprs1/coprs2双基因簇敲除突变株的构建方法，包含以下步骤：

6、(1)设计引物以恶臭假单胞菌kt2440基因组为模板扩增coprs1和coprs2的上游和下游序列片段作为基因敲除的同源臂，引物序列如下：

7、coprs1上游扩增引物：

8、coprs1ups：aggtaccgcatgcgatatcgagctcgccttgtcgcccaggttga；

9、coprs1upa：atcagcaggtcgtggtcgc；

10、coprs1下游扩增引物：

11、coprs1dns：gcgaccacgacctgctgat cggcaggaggacagatcaag；

12、coprs1dna：tttgtggaattcccgggagagctc cattgccatcctgcgtacct；

13、coprs2上游扩增引物：

14、coprs2ups：aggtaccgcatgcgatatcgagctcttttccgccttcaccagaac；

15、coprs2upa：cttcccatccttctagcccc；

16、coprs2下游扩增引物：

17、coprs2dns：ggggctagaaggatgggaag ggcaaccattgacccacaac；

18、coprs2dna：tttgtggaattcccgggagagctc ggctctgaccgtaggtatcg。

19、(2)分别将coprs1和coprs2的上游和下游片段同时通过重组酶连接连入经过saci酶切的线性化质粒pds3.0中，热激转化大肠杆菌s17-1λpir，得到pds-coprs1和pds-coprs2。

20、(3)将pds-coprs1通过接合转移从大肠杆菌s17-1λpir中导入恶臭假单胞菌中，涂布含庆大霉素和氯霉素的lb平板，得到第一次同源重组的菌株。

21、(4)将第一次同源重组的菌株扩大培养后，使用含蔗糖的培养基筛选第二次同源重组的菌株，在含氯霉素的lb平板上分离单菌落，使用引物coprs1wyzs和coprs1wyza进行pcr验证，得到coprs1敲除突变株，引物序列如下：

22、coprs1wyzs：tcggtgaacatcttgccttg；

23、coprs1wyza：tggtgatggtggtgaacgac。

24、(5)pds-coprs2通过接合转移从大肠杆菌s17-1λpir中导入恶臭假单胞菌的coprs1突变株中，涂布含庆大霉素和氯霉素的lb平板，得到第一次同源重组的coprs1突变株。

25、(6)将第一次同源重组的coprs1突变株扩大培养后，使用含蔗糖的培养基筛选第二次同源重组的菌株，在含氯霉素的lb平板上分离单菌落，使用引物coprs2wyzs和coprs2wyza进行pcr验证，得到coprs1/coprs2双敲除突变株，引物序列如下：

26、coprs2wyzs：catcaggtcctgaagcatgg；

27、coprs2wyza：cgaggcagaacaatggtgtg。

28、本发明第三个目的是提供恶臭假单胞菌coprs1/coprs2双基因簇敲除突变株在cu2+检测方面中的应用。所述突变株对cu2+的敏感度较高，可根据菌株的生长状态或作为cu2+感应报告载体的宿主菌应用于cu2+浓度水平检测的场景。

29、本发明具有以下有益效果：

30、本发明所提供的恶臭假单胞菌coprs1/coprs2双基因簇敲除突变株对cu2+的敏感度相对于野生型菌株(恶臭假单胞菌kt2440)有明显的提高，从而拓宽了恶臭假单胞菌在cu2+检测方面的应用。

技术特征：

1.一种对cu2+敏感的恶臭假单胞菌双基因簇敲除突变株，其特征在于，是将恶臭假单胞菌中的coprs1基因簇和coprs2基因簇敲除；coprs1基因簇的序列如seq id no.1所示；coprs2基因簇的序列如seq id no.2所示。

2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，是将coprs1基因簇从第147位到第1761位之间的编码序列以及coprs2基因簇从第185位到第1852位之间的编码序列敲除。

3.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌kt2440。

4.一种权利要求1或2所述的突变株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(1)中所述引物具体为：

6.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(4)中所述引物具体为：

7.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤(6)中所述引物具体为：

8.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述的恶臭假单胞菌为恶臭假单胞菌kt2440。

9.权利要求1-3任一项所述的突变株在cu2+检测方面中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述突变株对cu2+的敏感度较高，可根据菌株的生长状态或作为cu2+感应报告载体的宿主菌应用于cu2+浓度水平检测的场景。

技术总结
本发明公开了一种铜敏感型恶臭假单胞菌基因敲除突变株及其应用。它是利用同源重组基因敲除技术将恶臭假单胞菌的两套双组分系统copRS1和copRS2进行无痕敲除，所述的copRS1和copRS2基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。本发明所得的突变株对铜离子的敏感度显著提高，拓宽了恶臭假单胞菌在Cu<supgt;2+</supgt;检测场景中的应用。

技术研发人员：刘惠忠,谢小保,王颖思,施庆珊
受保护的技术使用者：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13