一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、纤连蛋白（fibronectin，fn）是高分子量糖蛋白，含糖4.5%-9.5%，其亚单位相对分子质量为22万－25万，是一种多功能的糖蛋白，在血浆中含量丰富，广泛分布于细胞外基质中，主要功能是介导细胞粘着。纯化的纤连蛋白可增强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型细胞的迁移和分化是必需的。在创伤修复中，纤连蛋白亦是重要的。在血凝块形成过程中，纤连蛋白促进血小板附着于血管受损部位。因此，纤连蛋白在医学、美容、护肤领域有广泛的应用前景。虽然动物组织、血液中含有纤连蛋白，但是含量极为有限，因此，组织来源的纤连蛋白存在产量低、成本高、产品纯度低的缺点。重组dna技术通过构建线路蛋白基因的表达载体，在原核或者真核生物中表达、制备高纯度的纤连蛋白。纤连蛋白单体约220～250kda，分子量较大，较长片段蛋白的重组表达效率往往较低，因此，现有的重组人fn蛋白片段均选择纤连蛋白上的部分结构域，通过重组dna技术制备含有纤连蛋白部分结构域，这些短片段表达的终产物大小在15-65kd，具有纤连蛋白的生物学活性。因此，如何筛选纤连蛋白的活性结构域进行重构，获得高活性、高稳定性的纤连蛋白是制约纤连蛋白应用的关键技术之一。此外，重组蛋白异源表达时，往往表达量低、活性低、可溶性低、纯度低，这也是制约纤连蛋白应用的另一关键技术。因此，如何设计fn功能结构域截短体的序列、提高表达效率、增强溶解性、活性和纯度，是亟待解决的技术问题。

技术实现思路

1、针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。

2、本发明提供一种高活性的重组人纤连蛋白，其氨基酸序列如seq id no.1所示，为截短突变体，大小约为150kd。

3、本发明还提供一种高活性的重组人纤连蛋白的编码序列，其核苷酸序列如seq idno.2所示。seq id no.2为原核密码子优化后的序列，seq id no.2所示的核苷酸序列表达后得到如seq id no.1所示的蛋白。

4、本发明还提供所述的高活性的重组人纤连蛋白的制备方法，包括如下步骤：对人纤连蛋白全长进行大肠杆菌密码子优化，并进行全基因合成，设计的功能结构域截短体的编码序列如seq id no.2所示，利用宿主表达系统进行诱导表达，用标签进行纯化，收获所述高活性的重组人纤连蛋白。宿主表达系统如大肠杆菌表达系统。

5、进一步的，所述的诱导表达步骤如下：挑取重组菌种单克隆至含有抗生素的培养基中，37℃摇床孵育过夜，稀释菌液，37℃摇床孵育至菌液od值为1-2，加入诱导剂诱导蛋白的表达，加入诱导剂后，摇床的温度降为16-30℃，诱导过夜；离心收集菌体，用裂解缓冲液重悬菌体，重悬后对菌体进行均质破碎；破碎后，裂解溶液进行离心取上清，滤膜过滤去除杂质，对裂解液上清进行超滤浓缩。所述诱导剂为iptg或阿拉伯糖。

6、进一步的，所述裂解缓冲液中含20mm 磷酸盐缓冲液，nacl含量为0-300mm，ph值为7.2-7.8。

7、进一步的，所述重悬菌体的操作中菌体与缓冲液重悬比例为1:10-1:40 w/v。

8、进一步的，所述的纯化步骤如下：超滤浓缩后的重组人纤连蛋白进行亲和层析，上样缓冲液使用咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤，将重组人纤连蛋白洗脱，电泳检测其各峰中重组人纤连蛋白的含量与纯度；超滤系统以pbs置换缓冲液除内毒素，并浓缩目的重组人纤连蛋白。

9、进一步的，所述上样缓冲液含有20-50mm咪唑，使用50-500mm咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤。

10、本发明还提供所述高活性的重组人纤连蛋白在制备化妆品原料中的应用。

11、本发明还提供所述高活性的重组人纤连蛋白在制备细胞培养试剂中的应用。

12、综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：

13、（1）现有技术表达的重组蛋白都是65kd以下的功能域蛋白，本发明表达的重组人纤连蛋白含有更为完整的功能结构域区段，最终蛋白大小约为150kd，提高了重组蛋白的活性。

14、（2）本发明对于基因序列进行了大肠杆菌偏好密码子优化，提高大片段的重组fn蛋白的表达量，如图1。图中，hfn为以人的细胞的cdna为模板，pcr扩增与rehfn氨基酸序列相同的区段，并克隆到原核表达载体中进行表达。rehfn为针对大肠杆菌进行了原核密码子优化后的序列，基因合成并克隆到原核表达载体中进行表达。其中0h，2h，4h表示诱导时间。对比hfn和rehfn的表达情况，可以显著看出，优化后的重组fn表达效果显著强于未优化的基因序列表达量（分子量130-180kd之间的条带）。

15、（3）本发明采用优化的培养条件和裂解缓冲体系，提高大肠杆菌表达的较大片段的重组人fn蛋白的可溶性，因为可溶性提高，省略了变复性步骤，简化了纯化步骤，提高了蛋白收率。

16、（4）采用以聚丙烯酸酯微球为基质材料的ni-nta填料进行亲和层析，达到单步纯化即可收获高纯度的重组人fn蛋白。

技术特征：

1. 一种高活性的重组人纤连蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

2. 一种高活性的重组人纤连蛋白的编码序列，其特征在于：其核苷酸序列如seq idno.2所示。

3.权利要求1所述的高活性的重组人纤连蛋白的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的诱导表达步骤如下：

5. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述裂解缓冲液中含20mm 磷酸盐缓冲液，nacl含量为0-300mm，ph值为7.2-7.8。

6. 根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述重悬菌体的操作中菌体与裂解缓冲液重悬比例为1:10-1:40 w/v。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的纯化步骤如下：

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述上样缓冲液含有20-50mm咪唑，使用50-500mm咪唑浓度梯度洗脱方式洗涤。

9.权利要求1所述的高活性的重组人纤连蛋白在制备化妆品原料中的应用。

10.权利要求1所述的高活性的重组人纤连蛋白在制备细胞培养试剂中的应用。

技术总结
本发明公开了一种高活性的重组人纤连蛋白及其制备方法和应用。本发明提供的重组人纤连蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。设计的功能结构域截短体极大地保留了纤连蛋白与细胞相作用区段及相关功能结构域，其最终蛋白大小约为150KD，收获高纯度且能够更好激活细胞黏附、细胞活力以及增殖能力的重组人纤连蛋白。

技术研发人员：王雪云,何智敏,吴灼斌,梁富,叶才文,徐江波,刘璐,周维,黄致翔,赖婵丹
受保护的技术使用者：深圳市卫光生物制品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13