一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法

本发明属于生物疫苗制品，具体涉及一种表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备疫苗中的应用。

背景技术：

1、猪塞内卡病毒(seneca virus，sva)是近几年新发现的一种动物疫病病毒，该病毒能够引起不同年龄阶段的猪产生水疱性病变、腹泻、跛行，甚至可引起新生仔猪大量死亡。猪塞内卡病毒sva导致的病症在临床症状上与猪口蹄疫、猪水疱病极为相似，而预防猪塞内卡病毒感染对控制猪水疱性疾病具有重要意义，疫苗是预防猪塞内卡病毒感染的最有效措施。

2、vp2蛋白是sva的结构蛋白之一，具有较强的免疫原性，是制备猪塞内卡病毒亚单位疫苗理想的候选靶标。目前使用的大肠杆菌表达系统进行vp2蛋白表达时主要以包涵体形式的蛋白出现，可溶性表达产量低。包涵体形式的蛋白作为疫苗抗原来使用效果不佳，而且需要多道工艺对蛋白进行纯化，在生产过程中大肠杆菌会产生大量内毒素，处理方法复杂，不能满足实际生产的需求。

3、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)是一种分布广泛、需氧并产芽孢的革兰氏阳性杆菌，遗传背景清晰，无致病性，已被美国食品药品监督管理局(fda)评为生物安全菌株(gras)。改造后的枯草芽孢杆菌wb800n已经解决野生型菌株bacillus subtilis168在生长过程中降解表达产物的问题，成为猪塞内卡病毒vp2蛋白的理想表达宿主。

4、基于上述考虑，本发明人通过构建表达猪塞内卡病毒vp2蛋白的重组枯草芽孢杆菌，解决vp2蛋白以包涵体形式出现的问题。猪塞内卡病毒vp2蛋白高效地分泌到胞外，极大地简化蛋白纯化流程、缩短生产周期，但我们又发现vp2蛋白表达量不能满足大规模生产的需要。在此基础上，本发明人通过改造vp2蛋白，筛选获得高水平表达重组蛋白的枯草芽孢杆菌，并且增强重组蛋白的免疫原性。

技术实现思路

1、为解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。

2、本发明首先提供一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒vp2蛋白的表达载体；

3、所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其一种具体的氨基酸序列为seq id no：1，编码基因的核苷酸序列为seq id no：2；

4、在保留vp2蛋白的免疫原性的基础上，为了提高vp2蛋白的表达效率，本发明还提供一种重组多肽，所述的重组多肽是将vp2蛋白截短体通过linker连接组成，其中重组蛋白的一种氨基酸序列如seq id no：3所示，其编码基因的核苷酸序列如seq id no：4所示。

5、所述的表达载体，作为一个实施例的具体记载，为pht43-his-rvp2高效表达载体。

6、本发明还提供一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其包含猪塞内卡病毒重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如seq id no：3所示。

7、作为优选，所述猪塞内卡病毒重组蛋白为应用本发明所述的重组枯草芽孢杆菌表达得到。

8、本发明所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本发明使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pht43-his-rvp2高效表达载体的枯草芽孢杆菌表达获得，所述pht43-his-rvp2高效表达载体通过同源重组技术获得，不仅实现了猪塞内卡病毒重组蛋白的高水平表达，而且能够高效分泌到细胞外，极大地简化了重组蛋白的制备流程，有利于重组蛋白抗原的大规模生产。在此基础上，本发明提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，具有良好的免疫原性和安全性，能够有效激活机体的免疫反应，刺激免疫兔体内产生特异性igg抗体及保护性中和抗体，具有较高应用价值和经济价值。本发明提供的猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗还具有制备方法简单高效、生产周期短、生产成本低等优势。

技术特征：

1.一种重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌中包含有重组表达猪塞内卡病毒vp2蛋白的表达载体。

2.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其氨基酸序列为seq id no：1。

3.如权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为seq id no：2。

4.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其氨基酸序列为seq id no：3。

5.如权利要求4所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其编码基因的核苷酸序列为seq id no：4。

6.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白，其氨基酸序列为seq id no：3。

7.如权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌，其特征在于，所述的表达载体为pht43-his-rvp2高效表达载体。

8.一种猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其抗原包含有氨基酸序列为seq id no：3的猪塞内卡病毒vp2蛋白。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征在于，所述的猪塞内卡病毒vp2蛋白是通过权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌工程菌表达制备的。

10.一种猪塞内卡病毒抗原蛋白，其特征在于，所述的抗原蛋白的氨基酸序列为seq idno：3。

技术总结
本发明提供一种用于表达猪塞内卡病毒重组蛋白的枯草芽孢杆菌及其在制备猪塞内卡病毒重组蛋白疫苗中的应用。所述的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3。本发明所构建的枯草芽孢杆菌表达系统安全无毒，能够高效分泌猪塞内卡病毒重组蛋白。本发明使用的猪塞内卡重组蛋白是通过转入pHT43‑His‑rVP2高效表达载体的枯草芽孢杆菌表达获得，所述pHT43‑His‑rVP2高效表达载体通过同源重组技术获得，不仅实现了猪塞内卡病毒重组蛋白的高水平表达，而且能够高效分泌到细胞外，极大地简化了重组蛋白的制备流程，有利于重组蛋白抗原的大规模生产。

技术研发人员：杨珍,刘刚,李明义,郭亚飞,李易,刘信冉,张新玲
受保护的技术使用者：青岛海华众康科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14