鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对及其应用

本发明属于烟草黑胫病分子鉴定领域，具体涉及鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对及其应用。

背景技术：

1、烟草黑胫病是由寄生疫霉菌(phytophtora parasitica var.nicotianaetucker)引起的土传性真菌病害，是烟草上最重要的根茎病害之一，俗称烟草疫病，每年给烟草生产造成巨大损失。种植抗病品种是防治此病最为有效的措施，在使用抗病品种时,烟草黑胫病菌致病性发生变异的可能性是需要考虑的重要问题。在烟草种植历史上,曾发生过因高毒力菌系或新小种出现而使一些抗病品种丧失对该病的抗性。如烤烟品种nc1071和白肋烟品系l8对烟草黑胫病菌0号生理小种是高度抗病的,但由于1号生理小种的出现而使该品种几乎丧失使用价值。

2、随着测序技术的迅猛发展，疫霉菌的基因组研究进展迅速。目前，一些重要的植物疫霉种的基因组已经完成全基因组测序并公布，如致病疫霉菌，大豆疫霉菌，橡树疫霉菌，辣椒疫霉菌和烟草黑胫病菌。这些疫霉菌的基因组大小不等，最大的是致病疫霉菌，为240mb，最小的为辣椒疫霉菌，为63mb。2016年，烟草黑胫病菌全基因组序列发表，0号生理小种基因组大小为80mb。可以看出，烟草黑胫病菌的基因组大小在已测序的这几个疫霉菌中处于中间位置，远小于致病疫霉菌，与大豆疫霉菌大小相近(95mb)。

3、目前黑胫病生理小种的鉴定方法主要是生物学鉴定方法。例如，专利申请cn201510670594.1公开的烟草黑胫病菌生理小种的鉴定方法，包括以下步骤：(1)将经消毒处理的不同鉴别寄主的种子分别接种到组培瓶中无菌培养基上培养鉴别寄主幼苗，将烟草黑胫病菌不同生理小种的菌丝分别接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对烟草黑胫病菌各生理小种的抗病反应；(2)从感染样品中分离、纯化出病原菌，将初步鉴定为烟草黑胫病菌的病原菌菌丝接种到生长有鉴别寄主幼苗的培养基上，统计不同鉴别寄主对病原菌的抗病反应，对比步骤(1)中统计结果，判定病原菌的生理小种类型。专利申请cn200910094995.1采用鉴别寄主在田间的抗病反应与采集菌株在ttc固体培养基平板上的颜色变化相结合的方法，鉴定出对所测病圃中烟草黑胫病菌的生理小种。专利申请cn201610264916.7将烟草黑胫病菌扩繁后打取菌蝶接种到湿热灭菌处理的小麦粒上，摇匀后置于26℃培养至每个小麦粒上均匀长满菌丝，然后接种到鉴别寄主nc 1071、l8和hick`s或小黄金1025的叶期幼苗土壤中，每株幼苗接2粒，接种12d后，调查各鉴别寄主死亡数，3株鉴别寄主中2株以上死亡即为感病，反之抗病，根据抗感反应确定相应的生理小种。

4、这些传统的黑胫病生理小种鉴定方法存在鉴定程序繁琐、鉴定结果不准确、耗费人力物力等缺点，致使烟草黑胫病生理小种的划分长期存在鉴定结果混乱，鉴定结果不准确等问题，严重影响烟草黑胫病防治和烟草抗病育种进程。

技术实现思路

1、针对烟草黑胫病生理小种的鉴定方法存在鉴定程序繁琐、鉴定结果不准确、耗费人力物力的上述问题，本发明提供一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对及其应用，本发明根据黑胫病菌0号生理小种基因组序列筛选到一段核苷酸序列，命名为hj0，其碱基序列为seq id no:3：

2、tcgtgccgaaacaagaccgagcccatcgacttctcctttcagattgnccgtagctttaggctattcaaggctcaagtagcaaccgaattcanccgtcgtctgccaaacgattggcaggatgacttcagcgtctatctcaagcccaccaagcacgctccacaacgtga。

3、序列hj0为0号生理小种所独有，只存在于0号生理小种，1号生理小种基因组内不包含该核苷酸序列。利用该序列设计特异性引物进行pcr扩增，进行黑胫病生理小种的分子鉴定，可以准确鉴定0号生理小种。该方法具有操作简单、鉴定结果准确的优点。

4、本发明的技术方案为：一种用于鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对，其上游引物核苷酸序列如seq id no:1所示，其下游引物核苷酸序列如seq id no:2所示。

5、seq id no:1：tcgtgccgaaacaagaccga

6、seq id no:2：tcacgttgtggagcgtgctt

7、一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的试剂盒，包含上述引物对。

8、进一步的，所述试剂盒还包含pcr缓冲液、聚合酶、dntp mix及ddh20。

9、一种利用上述引物对鉴定烟草黑胫病0号生理小种的方法，包括如下步骤：提取待鉴定样本的基因组dna并作为模板，利用以上所述的pcr引物对对基因组dna中的基因片段hj0进行pcr扩增，hj0的碱基序列如seq id no:3所示；对扩增产物进行检测，若出现167bp的dna条带，则待测样本为0号生理小种，否则不是0号生理小种。

10、进一步的，pcr扩增反应条件为：94℃变性1min；而后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min；4℃保温。

11、有益效果：

12、本发明提供的pcr引物对的特异性好，鉴定烟草黑胫病0号生理小种的准确性高，方法简单高效，在分子水平上对黑胫病0号生理小种进行鉴定，避免了传统生物学鉴定方法的缺陷，可解决长期存在的黑胫病生理小种的鉴定难题。

技术特征：

1.一种用于鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对，其特征在于，其上游引物核苷酸序列如seq id no:1所示，其下游引物核苷酸序列如seq id no:2所示。

2.一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所示的引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含pcr缓冲液、聚合酶、dntp mix及ddh20。

4.一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待鉴定样本的基因组dna作为模板，利用权利要求1所述的引物对对基因组dna中的基因片段hj0进行pcr扩增，hj0的碱基序列如seq id no:3所示；对扩增产物进行检测，若出现167bp的dna条带，则待测样本为0号生理小种。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，pcr扩增反应条件为：94℃变性1min；而后进行35个循环，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸10min；4℃保温。

技术总结
本发明属于烟草黑胫病分子鉴定领域。针对黑胫病生理小种的鉴定方法，存在鉴定程序繁琐、鉴定结果不准确的缺点，提供一种鉴定烟草黑胫病0号生理小种的引物对及其应用。引物对核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。提取待鉴定样本的基因组DNA并作为模板，利用以上所述的引物对对基因组DNA中的基因片段HJ0进行PCR扩增，HJ0的碱基序列如SEQ ID NO:3所示；对扩增产物进行检测，若出现167bp的DNA条带，则待测样本为0号生理小种。本发明提供的PCR引物对的特异性好，鉴定烟草黑胫病0号生理小种的准确性高，方法简单高效，解决了黑胫病生理小种的鉴定难题。

技术研发人员：王文静,王凤龙,曹毅,方敦煌
受保护的技术使用者：中国农业科学院烟草研究所（中国烟草总公司青州烟草研究所）
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13