一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取和纯化方法

本发明属于细胞生物学，具体涉及一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取和纯化方法。

背景技术：

1、肠道是参与机体免疫的重要器官，通过识别暴露在复杂生理环境中抗原信息并做出适当的响应，以维持肠道稳态。其中，肠道固有层是除肠上皮细胞和肠淋巴结以外，肠道免疫系统的重要组成部分。肠道稳态的破坏会引起溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)等炎症性肠病的发生。结肠是肠道疾病的高发部位，其稳态的维持对肠道健康至关重要。研究证实，由巨噬细胞组成的固有免疫系统对uc的发生、发展存在高度的相关性。开展结肠固有层巨噬细胞的研究，可从固有免疫角度揭示肠道基于外界干扰的免疫应答，对免疫调控的节点和药物治疗靶点的发现具有重要意义。

2、现有中国发明专利202111673250.8公开了一种高效高活性的小鼠肠道上皮与免疫细胞分离提取方法，但该专利是针对小肠上皮免疫细胞的分离，而结肠黏膜表面存在比小肠更厚的黏液层，该黏液层大大阻碍了单细胞的滤过，降低了单细胞悬液制备效率，使得细胞死亡率提升。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取和纯化方法，排除肠上皮细胞干扰，省时、高效地制备得到小鼠结肠固有层巨噬细胞，细胞得率高、活性高达96.85％。

2、本发明提供了一种结肠黏液和上皮细胞的解离液，包括独立包装的解离液1和解离液2；

3、所述解离液1包括以下体积百分含量的物质：1％～2％的0.1m dtt，1％～2％的1mhepes和96％～98％的pbs缓冲液；

4、所述解离液2包括以下体积百分含量的物质：1％～3％的1m edta，1％～2％的1mhepes和95％～98％的pbs缓冲液。

5、本发明还提供了一种利用上述解离液解离动物结肠内黏液和上皮细胞的方法，包括以下步骤：将清洗干净的结肠截短为肠段，振荡后依次置于解离液1和解离液2中进行解离，去除残留黏液和结肠上皮细胞。

6、优选的，所述解离包括：将肠段与解离液1混合，300～500rpm第一振荡10～12分钟，1000～1500rpm第二振荡2～3分钟；

7、将经所述第二振荡的肠段与解离液2混合，300～500rpm第三振荡10～12分钟，1000rpm第四振荡2～3分钟。

8、本发明还提供了一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取方法，包括以下步骤：

9、(1)利用上述方法解离动物结肠内黏液和上皮细胞后，对结肠剩余物进行酶解，得细胞悬液；利用ⅰ型胶原酶进行所述酶解；

10、(2)差速离心法收集所述细胞悬液的上清液中的细胞沉淀，利用percoll溶液进行密度梯度离心，收集中间细胞相，所述细胞相中含动物结肠固有层巨噬细胞。

11、优选的，步骤(1)所述酶解包括将结肠剩余物利用pbs缓冲液漂洗后，与含胶原酶的消化液混合，37℃酶解10分钟后终止酶解，将酶解后的结肠碎片研磨后，浸入含完全培养基的消化液中，使用70μm细胞滤器过滤，得细胞悬液。

12、优选的，所述消化液包括以下体积百分含量的物质：13％～16％的fbs，1％的青霉素、链霉素双抗，1％的75mg/mlⅰ型胶原酶和82％～85％的rpmi 1640培养基；

13、所述完全培养基包括以下体积百分含量的物质：13％～16％的fbs，1％的青霉素、链霉素双抗和83％～86％的rpmi 1640培养基。

14、优选的，步骤(2)所述差速离心包括：细胞悬液于40～60×g离心5～8分钟，取上清，上清于250～300×g离心10～15分钟，取细胞沉淀。

15、优选的，步骤(2)所述密度梯度离心，包括：用40％浓度percoll溶液重悬细胞沉淀后，与80％浓度percoll溶液混合，进行密度梯度离心。

16、本发明还提供了一种动物结肠固有层巨噬细胞的纯化方法，包括以下步骤：将利用上述提取方法得到的细胞相重悬后，利用流式细胞分选得到纯化的巨噬细胞。

17、优选的，所述流式细胞分选包括：利用通道apc-cyanine 7在细胞群落中标记活细胞，通过fitc通道的cd45抗体、pe/dazzletm594通道的f4/80抗体、percp-cyanine 5.5通道的cd11b抗体进行巨噬细胞标记和分选。

18、有益效果：本发明提供了一种结肠黏液和上皮细胞的解离液，利用解离液1和解离液2依次对结肠组织进行解离，大大提高了结肠黏液的去除率，耗时大为减少，为后续研究的高效开展节省了时间成本。本发明利用经解离后的动物结肠提取结肠固有层巨噬细胞，依次包括酶解、差速离心和percoll溶液密度梯度离心，收集得到含有巨噬细胞的细胞相。本发明还提供了对固有层巨噬细胞的纯化方法，采用流式分选的方法对细胞相的悬液进行分选，分离的结肠固有层免疫细胞分群明显，巨噬细胞标记明显，可以进一步将m1型(cd86+)和m2型(mchⅱ+)巨噬细胞，以及招募型(ly6c+cx3cr-)巨噬细胞进行区分。结肠固有层巨噬细胞得率高、活性高，可广泛应用于肠道巨噬细胞免疫的相关研究，尤其在结肠固有层巨噬细胞进一步分型方面具有很高的应用价值。

技术特征：

1.一种结肠黏液和上皮细胞的解离液，其特征在于，包括独立包装的解离液1和解离液2；

2.一种利用权利要求1所述解离液解离动物结肠内黏液和上皮细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将清洗干净的结肠截短为肠段，振荡后依次置于解离液1和解离液2中进行解离，去除残留黏液和结肠上皮细胞。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述解离包括：将肠段与解离液1混合，300～500rpm第一振荡10～12分钟，1000～1500rpm第二振荡2～3分钟；

4.一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于，步骤(1)所述酶解包括将结肠剩余物利用pbs缓冲液漂洗后，与含胶原酶的消化液混合，37℃酶解10分钟后终止酶解，将酶解后的结肠碎片研磨后，浸入含完全培养基的消化液中，使用70μm细胞滤器过滤，得细胞悬液。

6.根据权利要求5所述提取方法，其特征在于，所述消化液包括以下体积百分含量的物质：13％～16％的fbs，1％的青霉素、链霉素双抗，1％的75mg/mlⅰ型胶原酶和82％～85％的rpmi 1640培养基；

7.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(2)所述差速离心包括：细胞悬液于40～60×g离心5～8分钟，取上清，上清于250～300×g离心10～15分钟，取细胞沉淀。

8.根据权利要求4所述提取方法，其特征在于，步骤(2)所述密度梯度离心，包括：用40％浓度percoll溶液重悬细胞沉淀后，与80％浓度percoll溶液混合，进行密度梯度离心。

9.一种动物结肠固有层巨噬细胞的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：将利用权利要求4～8任一项所述提取方法得到的细胞相重悬后，利用流式细胞分选得到纯化的巨噬细胞。

10.根据权利要求9所述纯化方法，其特征在于，所述流式细胞分选包括：利用通道apc-cyanine 7在细胞群落中标记活细胞，通过fitc通道的cd45抗体、pe/dazzletm594通道的f4/80抗体、percp-cyanine 5.5通道的cd11b抗体进行巨噬细胞标记和分选。

技术总结
本发明公开了一种动物结肠固有层巨噬细胞的提取和纯化方法，属于细胞生物学技术领域。本发明提供了一种结肠黏液和上皮细胞的解离液，利用解离液1和解离液2依次对结肠组织进行解离，大大提高了结肠黏液的去除率，耗时大为减少。本发明利用经解离后的动物结肠提取结肠固有层巨噬细胞，依次包括酶解、差速离心和Percoll溶液密度梯度离心，收集得到含有巨噬细胞的细胞相。本发明还提供了对固有层巨噬细胞的纯化方法，采用流式分选的方法对细胞相的悬液进行分选，分离的结肠固有层免疫细胞分群明显，并可对不同类型的巨噬细胞进行区分。本发明方法简单，有效解决了结肠黏液导致的过滤速度慢等问题，耗时大为减少。

技术研发人员：宁张弛,王淳,赵宁,刘振丽,宋志前,彭诗涛
受保护的技术使用者：中国中医科学院中医基础理论研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13