一种基于LAMP和切割型Taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法及应用与流程

本发明涉及核酸快速定量检测，特别是一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法及应用。

背景技术：

1、分子诊断作为体外诊断的三大技术之一，发展最为迅速，具有巨大的市场容量，分子诊断的靶标分子主要是dna和rna核酸分子，其在科研、临床诊断、食品检测、法医鉴定等领域有着重要应用；现今的核酸检测技术种类多样，主要包括dna测序技术、聚合酶链式反应(pcr)、核酸质谱技术、等温核酸扩增技术、核酸杂交检测技术、核酸序列构型分析技术等，操作简单、检测时间短、检测通量与灵敏度高是以基因检测为主的分子诊断的发展方向；

2、聚合酶链式反应(pcr)技术是分子诊断技术中发展时间最长、最为成熟的技术，其中荧光定量pcr(qpcr)技术被认为是分子诊断的金标准，其被广泛用于传染病、遗传病、单核苷酸多态性的筛查检测，占据分子诊断的大部分市场；但qpcr检测流程繁琐，耗时较长，无法实现2小时内出具报告；qpcr检测一般需要在特定医疗检测机构开展，且需要在特定的pcr实验室中进行操作，操作人员需持证上岗，基层医院推广qpcr检测存在诸多困难和限制；

3、即时检测(poct，point－of－care testing)技术检测时长短，符合体外诊断的未来发展需求，目前体外诊断的生化诊断和免疫诊断基本实现了poct；而分子诊断虽然准确灵敏，但无论qpcr、基因测序都不能实现poct检测，因此poct便捷快检技术是分子诊断行业未来的发展趋势；

4、lamp又称环介导等温扩增技术，针对靶基因的6个区域设计6条特异引物，在链置换dna聚合酶(bst dna聚合酶)的作用下，利用基因模板、引物、dntp等，在60－65℃进行恒温扩增，15－60分钟左右即可实现109～1010倍的核酸扩增，作为一种新型的核酸扩增方法，lamp具有操作简单、特异性强等特点，是核酸快速检测的主要技术平台；若在反应体系中加入荧光探针分子和切割配对探针分子的酶，还可以实时监测lamp扩增产物量，对靶基因的扩增产物进行类似qpcr的定量分析；

5、taqman探针是一种短的寡核苷酸单链，一端为荧光基团标记，另一端为淬灭基团标记，荧光基团和淬灭基团距离很近，使得荧光基团不能发射出荧光，常规taqman探针与靶核酸杂交后，双链dna外切核酸酶(例如taq dna聚合酶的5’外切酶)从taqman探针末端水解探针，使得荧光基团与淬灭基团分离，从而发射出荧光信号；taqman探针发挥荧光定量作用依赖于双链dna外切核酸酶活性，然而常温核酸扩增技术中的大部分dna聚合酶不具有双链dna外切核酸酶活性，不能进行常规的taqman探针法荧光定量检测；

6、内切核酸酶iv是一种特异性的核酸内切酶，在dna双链中的无碱基位点(ap位点)处水解dna链；该酶消化含ap位点的单链dna的活性极低；因此其可以用来水解含一个ap位点的taqman探针，进行信号放大累积，克服常规taqman探针和等温扩增dna聚合酶不能在等温核酸扩增检测中进行信号放大的问题，将taqman探针与lamp技术相偶联，使dna的恒温扩增的荧光定量检测成为了可能，为分子诊断的poct应用打下了基础。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决上述问题，设计了一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法及应用。

2、实现上述目的本发明的技术方案为，一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，包括以下工作步骤：

3、步骤一：制备中间带一个无碱基位点的taqman探针；

4、步骤二：lamp等温核酸扩增反应体系的建立；

5、步骤三：lamp扩增反应和荧光信号放大反应；

6、步骤四：确定靶核酸分子的浓度。

7、对本技术方案的进一步补充说明，所述无碱基位点为ap位点，其为四氢呋喃环、烷烃链、乙二醇聚合物中的任意一种。

8、对本技术方案的进一步补充说明，所述taqman探针两端分别用荧光发射基团和荧光淬灭基团标记，无荧光释放出来。

9、对本技术方案的进一步补充说明，所述荧光发射基团为fam、rox、vic、cy5等任意一种。

10、对本技术方案的进一步补充说明，所述荧光淬灭基团为bhq1、bhq2等任意一种。

11、对本技术方案的进一步补充说明，所述lamp等温核酸扩增反应体系的建立包括以下工作流程：将扩增目标dna的引物、dntp、bst dna聚合酶大片段、检测样本dna、热稳定性内切核酸酶iv、上述taqman探针，加入lamp等温核酸扩增的反应体系中，配制反应混合物。

12、对本技术方案的进一步补充说明，所述lamp扩增反应和荧光信号放大反应具体包括以下工作步骤：将lamp等温核酸扩增的反应体系的反应混合物在便携式荧光检测仪或荧光定量pcr仪中于65度保温一定时间，进行目标基因的扩增与荧光定量检测。

13、对本技术方案的进一步补充说明，所述保温时间优选30－90分钟。

14、对本技术方案的进一步补充说明，确定靶核酸分子的浓度是根据荧光的增长曲线，确定检测样本是否含有靶核酸检测及其浓度。

15、一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法在等温核酸荧光定量检测中的应用。

16、其有益效果在于，(1)taqman探针中间带有一个无碱基位点修饰，可以被内切核酸酶iv切断，永久释放并累积荧光信号；(2)内切核酸酶iv来源于耐热微生物，因此整个荧光信号的释放反应(taqman探针切断反应)可以在65度下与lamp等温扩增技术相偶联，实现dna和rna的等温核酸荧光定量检测；(3)荧光信号的释放反应与lamp等温扩增反应的耦合检测，实现了恒温下核酸扩增与信号检测，克服了对荧光定量pcr的绝对依赖性，提高了靶核酸的检测灵敏度。

技术特征：

1.一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，其特征在于，包括以下工作步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，其特征在于，所述无碱基位点为ap位点，其为四氢呋喃环、烷烃链、乙二醇聚合物中的任意一种。

3.根据权利要求1所述的一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，其特征在于，所述lamp等温核酸扩增反应体系的建立包括以下工作流程：将扩增目标dna的引物、dntp、bstdna聚合酶大片段、检测样本dna、热稳定性内切核酸酶iv、上述taqman探针，加入lamp等温核酸扩增的反应体系中，配制反应混合物。

4.根据权利要求1所述的一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，其特征在于，所述lamp扩增反应和荧光信号放大反应具体包括以下工作步骤：将lamp等温核酸扩增的反应体系的反应混合物在便携式荧光检测仪或荧光定量pcr仪中于65度保温一定时间，所述保温时间优选30－90分钟，进行目标基因的扩增与荧光定量检测。

5.据权利要求1－4任一项所述的一种基于lamp和切割型taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法在等温核酸荧光定量检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于LAMP和切割型Taqman探针的等温核酸荧光定量快检方法，包括以下工作步骤：步骤一：制备中间带一个无碱基位点的Taqman探针；步骤二：LAMP等温核酸扩增反应体系的建立；步骤三：LAMP扩增反应和荧光信号放大反应；步骤四：确定靶核酸分子的浓度；本发明的有益效果是，实现了恒温下核酸扩增与信号检测，克服了对荧光定量PCR的绝对依赖性，提高了靶核酸的检测灵敏度。

技术研发人员：金正
受保护的技术使用者：苏州拜科生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13