一种胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法与流程

本发明涉及细胞生物学，具体涉及一种胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法。

背景技术：

1、胰腺癌被称为癌中之王，是恶性程度最高的消化道肿瘤，确诊后5年生存率低于8％。无论从诊断、治疗还是基础研究方面，虽然进展很多，但仍举步维艰，胰腺癌的发病机制仍不是很清楚。其中一个重要原因就是胰腺单细胞难以获取，进而制约了许多研究。胰腺在体内可分泌大量的消化酶，这些消化酶在体内并不会对胰腺组织造成损伤。然而，一旦胰腺离体后，胰液内的消化酶就会对胰腺细胞活性造成影响，造成制备的胰腺单细胞细胞数少以及细胞活率低下，进而影响后续的研究。因此如果能够有一种胰腺组织消化的专用试剂盒来处理胰腺组织而又不对胰腺细胞造成损伤，将会对进一步针对胰腺细胞的研究带来益处。

2、目前文献中常使用的消化酶体系并不能稳定产出高细胞产量、高细胞活率的单细胞悬液供后续研究。本发明正是基于这一出发点进行研究。本发明中胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法相比传统所用的胶原酶消化方法，具有对细胞损伤小、细胞产量多、细胞活率高的优点。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法，能够降低对胰腺细胞的损伤，获得高的胰腺细胞的得率以及活率。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种胰腺组织消化专用试剂盒，包括c液、h液、d液、i液、f液、b液；

4、所述c液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：胶原蛋白酶iv 20，bsa2.5，葡萄糖0.1125，l-谷氨酰胺0.0146，余量为水；

5、所述h液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：透明质酸酶25，bsa 2.5，葡萄糖0.1125，l-谷氨酰胺0.0146，余量为水；

6、所述d液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：脱氧核糖核酸酶10，tirs-hcl 1.576，nacl 8.766，mgcl2 0.2033，余量为水，然后与等体积的甘油混合；

7、所述i液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：胰蛋白酶抑制剂10，l-谷氨酰胺0.0146，余量为水；

8、所述f液是由以下浓度的组分组成，各浓度单位为mg/ml：脱氧核糖核酸酶10，bsa0.5，余量为ph7.1-7.3、1mm-100mm的磷酸盐缓冲液；

9、所述b液是由以下浓度的组分组成，除内切核酸酶浓度，其余各浓度单位为mg/ml：内切核酸酶250units/μl，tirs-hcl 3.152，mgcl2 0.019，nacl 1.1688，余量为水，然后与等体积的甘油混合。

10、本发明第二方面提供了一种胰腺组织消化方法，利用上述胰腺组织消化专用试剂盒进行胰腺组织消化，包括如下步骤：

11、步骤一、储备液稀释、混合：将c液、h液、d液和i液分别稀释10、10、40、10倍，然后将稀释好的c液、h液、d液和i液等体积混合，得到胰腺组织消化液；

12、步骤二、胰腺组织清洗、称重：使用rpmi1640培养基对胰腺组织进行清洗，然后弃去多余rpmi1640培养基，称重，计算、准备消化该质量数的胰腺组织所需要的胰腺组织消化液，≤1g胰腺组织准备2份胰腺组织消化液，每份胰腺组织消化液为1ml胰腺组织消化液，1g＜胰腺组织≤2g准备2份胰腺组织消化液，每份胰腺组织消化液为2ml胰腺组织消化液，以此类推；

13、步骤三、粉碎胰腺组织：用剪刀剪碎胰腺组织，使胰腺组织碎块尽可能细小；

14、步骤四、消化胰腺组织：首先取1份胰腺组织消化液加入到待消化的胰腺组织中，37℃、250rpm水浴消化20min；20min后回收一半胰腺组织消化液到新的离心管中，再补充0.5份胰腺组织消化液，再次消化20min；当完成消化后，继续转移一半胰腺组织消化液到上述回收胰腺组织消化液的离心管中，再次补充0.5份胰腺组织消化液，继续消化20min后，回收所有胰腺消化液到上述回收胰腺组织消化液的离心管中；

15、步骤五、过滤离心：将回收的胰腺组织消化液过70μm滤筛，≤2g胰腺组织使用50mlf液冲洗滤筛，收集滤液，400g室温离心10min；

16、步骤六、核酸消化：≤2g胰腺组织使用2ml f液重悬沉淀，加入2ul b液，37℃水浴30min；

17、步骤七、过滤：过70μm滤筛，收集滤液；

18、步骤八、计数：在显微镜下计数，计算细胞数及活率。

19、本发明的有益效果：

20、本发明相对其他消化方法，创新性地采用了胶原蛋白酶iv、透明质酸酶和脱氧核糖核酸酶作为消化酶组合，经测试调整的酶消化浓度，并通过多轮弱消化，尽可能不因为过度消化导致胰腺组织细胞破损，并配合合适浓度的胰蛋白酶抑制剂，避免胰腺组织分泌的消化酶对胰腺组织细胞产生破坏作用，从而实现高的胰腺细胞得率和活率。

21、采用本发明胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法在胰腺组织消化、胰腺单细胞获取过程中，具有对细胞损伤小、细胞得率高、细胞活率高的优点。

技术特征：

1.一种胰腺组织消化专用试剂盒，其特征在于，包括c液、h液、d液、i液、f液、b液；

2.一种胰腺组织消化方法，其特征在于，利用权利要求1所述的胰腺组织消化专用试剂盒进行胰腺组织消化，包括如下步骤：

技术总结
本发明公开了一种胰腺组织消化专用试剂盒，包括C液、H液、D液、I液、F液、B液。本发明还公开了利用所述胰腺组织消化专用试剂盒进行胰腺组织消化的方法。采用本发明胰腺组织消化专用试剂盒及胰腺组织消化方法在胰腺组织消化、胰腺单细胞获取过程中，具有对细胞损伤小、细胞得率高、细胞活率高的优点。

技术研发人员：林铖,王平,仇陈盛,张田宇
受保护的技术使用者：杭州普罗亭医学检验实验室有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13