一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法与流程

本发明属于生物化学，主要涉及基因工程相关技术，具体涉及一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法。

背景技术：

0、技术背景

1、金属硫蛋白（metallothionein）是一种金属结合蛋白，定位在真核生物中，其分子量较低，半胱氨酸含量较高。人源金属硫蛋白基因位于16号染色体的q13区，小鼠金属硫蛋白基因位于8号染色体。金属硫蛋白mt分为四个亚家族，分别为mt1、mt2、mt3和mt4。mt1和mt2在脏器中普遍表达，在肾脏、肝脏、肠道和胰腺中表达较高。mt3主要分布在大脑、心脏、视网膜、肾脏、乳房、前列腺、膀胱和生殖器官，mt4主要分布在分层鳞状上皮。金属硫蛋白不仅参与调节金属稳态和控制生物体内重金属毒性，也在dna损伤和氧化应激方面发挥重要作用。因此，金属硫蛋白的制备和应用获得了广泛关注。

2、mt1在生物体中发挥金属解毒作用，以维持体内平衡，防止金属过载导致的器官损伤。包括重金属、抗氧化剂、烷化剂、糖皮质激素、细胞因子和脂多糖等因素均可诱导mt1表达，产生免疫调节作用。多条信号通路参与mt1对免疫系统的调节，例如，mt1通过调节stat1和stat3信号传导从而诱导th17细胞的分化和功能。mt1也可以活化nf-κb，诱导nf-κb介导的基因表达，抑制细胞凋亡。

3、我国主要采用动物肝脏生产金属硫蛋白。但这一常规方法步骤繁琐，产量低，且消耗大量动物资源。虽然已有文献报道通过诱导大肠杆菌产出金属硫蛋白，但依旧面临着产量低这一问题。因此，寻找一种成本低、产量高的生产方法有助于金属硫蛋白的大规模生产，投入应用。

技术实现思路

1、本发明目的在于提供一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法。

2、本发明提供了一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，该表达载体的获得方法是将pcr扩增获得的金属硫蛋白质粒插入至表达载体，使该载体表达金属硫蛋白。

3、具体的，本发明提供了一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，包括以下步骤：

4、s1，获得含有编码金属硫蛋白的基因片段的质粒，所述质粒含有mlu1和nde1的酶切位点；

5、s2，获得慢病毒表达载体，并且使用mlu1和nde1双酶切；

6、s3，将步骤s1获得的含有编码金属硫蛋白的基因片段的质粒插入至步骤s2获得的慢病毒表达载体，使该载体表达金属硫蛋白；

7、s4，获得金属硫蛋白基因的慢病毒表达载体。

8、较好的，获得含有编码金属硫蛋白的基因片段包括：培养腺细胞，提取细胞的总rna，并逆转录为cdna。

9、较好的，通过pcr扩增获得的金属硫蛋白为金属硫蛋白1家族成员。可以包括金属硫蛋白1a、金属硫蛋白1b、金属硫蛋白1e、金属硫蛋白1f中的任意一种。例如，本发明的一个优选实施例中扩增的是mt1a。

10、较好的，插入pcr扩增产物获得的金属硫蛋白的表达载体为mt1a表达载体；或者将扩增回收的、含有编码金属硫蛋白的基因序列的双酶切后，连接到载体phr-sin。

11、较好的，质粒插入载体的位点是酶切位点mlu1和nde1之间。

12、较好的，根据金属硫蛋白的cds区设计上下游扩增序列，以富含金属硫蛋白表达的细胞cdna为模板进行pcr扩增编码金属硫蛋白的基因序列。

13、较好的，pcr扩增cds序列片段时所需的上、下 游引物序列如下：

14、上游引物：mt1a-f:5’-gacgcgtcatggaccccaactgctc-3’(seq id no 1)，

15、下游引物：mt1a-r:5’-ccatatgggctgcacttctctg-3’(seq id no 2）。

16、相应的，本发明提供了一种硫蛋白基因慢病毒表达载体，所述的硫蛋白基因慢病毒表达载体使用上述金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法制备。

17、较好的，所述的硫蛋白基因慢病毒表达载体表达硫蛋白基因。

18、本发明还提供了所述金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法的应用，本发明的构建方法可以用于表达金属硫蛋白。

19、较好的，获得所述的金属硫蛋白的表达载体后可以将其转化，培养筛选菌种；接种菌种于细菌培养液，振荡过夜培养，使用试剂盒抽提质粒并测序。

20、本发明的有益效果是提供了一种mt基因慢病毒表达载体，能够高效表达金属硫蛋白。实验方案如下，根据金属硫蛋白的cds区设计上下游扩增序列，以富含金属硫蛋白表达的细胞cdna为模板进行pcr扩增金属硫蛋白，对扩增回收获得的质粒采用mlu1和nde1双酶切，并连接到载体phr-sin，得到富含金属硫蛋白表达的表达载体。将上述构建的表达载体转化，培养筛选菌种。接种菌种于细菌培养液，振荡过夜培养，使用试剂盒抽提质粒并测序。本发明克服了传统金属硫蛋白制备方法产量低、污染高的缺点，有效促进金属硫蛋白的表达并提高表达量，为金属硫蛋白的生产提供了新技术。

技术特征：

1.一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，获得含有编码金属硫蛋白的基因片段包括以下步骤：培养腺细胞，提取细胞的总rna，并逆转录为cdna；根据金属硫蛋白的cds区设计上下游扩增序列，以含有金属硫蛋白表达的细胞cdna为模板进行pcr扩增编码金属硫蛋白的基因序列。

3.根据权利要求1所述金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，通过pcr扩增获得的金属硫蛋白为金属硫蛋白1家族成员，包括金属硫蛋白1a、金属硫蛋白1b、金属硫蛋白1e、金属硫蛋白1f中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的过表达金属硫蛋白基因质粒的构建方法，其特征在于，pcr扩增cds序列片段时所需的上、下游引物序列如下：

5.根据权利要求1所述金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，插入pcr扩增获得的金属硫蛋白后所形成的表达载体为表达mt1a的载体；或者将扩增回收的、含有编码金属硫蛋白的基因序列的双酶切后，连接到载体phr-sin。

6.根据权利要求1所述所属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法，其特征在于，质粒插入载体的位点位于酶切位点mlu1和nde1之间。

7.一种硫蛋白基因慢病毒表达载体，其特征在于，所述的硫蛋白基因慢病毒表达载体根据权利要求1-6中任意一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法制备。

8.根据权利要求7所述的硫蛋白基因慢病毒表达载体，其特征在于，所述的硫蛋白基因慢病毒表达载体表达硫蛋白基因。

9.权利要求1-6中任意一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法的应用，其特征在于，表达金属硫蛋白。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，将权利要求1中所述的金属硫蛋白的表达载体转化，培养筛选菌种；接种菌种于细菌培养液，振荡过夜培养，使用试剂盒抽提质粒并测序。

技术总结
本发明属于生物化学技术领域，涉及一种金属硫蛋白基因慢病毒表达载体的构建方法。所述的构建方法包括以下步骤：S1，获得含有编码金属硫蛋白的基因片段，含有Mlu1和Nde1的酶切位点；S2，获得慢病毒表达载体；S3，将步骤S1获得的含有编码金属硫蛋白的基因片段的质粒插入至步骤S2获得的慢病毒表达载体，使该载体表达金属硫蛋白；S4，获得金属硫蛋白基因的慢病毒表达载体。本发明克服了传统金属硫蛋白制备方法产量低、污染高的缺点，有效促进金属硫蛋白的表达并提高表达量，为金属硫蛋白的生产提供了新技术。

技术研发人员：崔大祥,崔明青,周园园
受保护的技术使用者：国纳之星（上海）纳米科技发展有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13