从血液中分离提取检测AOC药物小核酸的试剂盒及其方法与流程

本发明属于分子生物学，具体涉及一种从血液中分离提取检测aoc药物小核酸的试剂盒及其方法。

背景技术：

1、寡核苷酸(小核酸)药物主要包括反义核酸(aso)、小干扰rna(sirna)、微小rna(mirna)、小激活rna(sarna)、信使rna(mrna)适配体(aptamer)、核酶(ribozyme)、抗体核酸偶联药物(arc)等。小核酸药物是与小分子药物、抗体药物完全不同的全新药物类别，其药物构成为核苷酸序列，药物机制为通过和靶基因mrna碱基互补配对引导沉默复合体(risc)降解mrna或抑制mrna的翻译，在转录后水平调控蛋白表达，从而实现治疗疾病的目的。寡核苷酸药物中的小核酸具有选择性，但仍面临血清不稳定、膜通透性低和缺乏组织选择性等挑战。而抗体具有更长的半衰期、在细胞内选择性递送药物的能力以及其靶向特性，被证明是靶向递送寡核苷酸的理想载体之一，抗体偶联小核酸(aoc，antibody oligonucleotideconjugate)即将抗体作为靶向递送寡核苷酸的载体，主要有三部分构成：发挥组织靶向作用的抗体、连接子(linker)和作为payload的小核酸。其中小核酸包括正义链和反义链，其中正义链通过共价键偶联在抗体上，反义链通过碱基互补配对与正义链形成双链。小核酸在人体内的组织和血液分布决定着aoc药物的药效，然而传统的小核酸提取试剂盒通过蛋白变性、离心等方法去除蛋白质等杂质，然后分离得到小核酸，而由于aoc药物是抗体通过共价键偶联小核酸药物，因此使用传统的方法会将抗体上偶联的小核酸去除，难以将aoc药物上的小核酸分离提取出来，因此市场上缺少高效的试剂盒或方法检测aoc药物小核酸的血液分布。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种从血液中分离提取检测aoc药物小核酸的试剂盒及其方法。

2、为实现本发明目的，本发明提供一种从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，包括裂解液ⅰ、裂解液ⅱ和工作液，所述裂解液ⅰ包括0.05-0.09m磷酸盐缓冲液、0.5-1.5m氯化钠和0.1-0.4％ tritonx-100，所述裂解液ⅰ的ph为6.0-7.0，所述裂解液ⅱ包括50-150μg/ml蛋白酶k、20-80mm tris-hcl和7-13nm氯化钙，所述裂解液ⅱ的ph为7.0-8.0，所述工作液包括200-300mm tris-hcl、350-400mm氯化钾、10-20nm氯化镁、0.05-0.15m dtt、20-60u/μl rnase抑制剂和0.5-5u逆转录酶，所述工作液的ph为8.0-8.6。

3、进一步的，所述裂解液ⅰ由0.07m磷酸盐缓冲液、1m氯化钠和0.25％tritonx-100组成，所述裂解液ⅰ的ph为6.5。

4、进一步的，所述裂解液ⅱ由125μg/ml蛋白酶k、50mm tris-hcl和10nm氯化钙组成，所述裂解液ⅱ的ph为7.5。

5、进一步的，所述工作液由250mm tris-hcl、375mm氯化钾、15nm氯化镁、0.1m dtt、40u/μl rnase抑制剂和1u逆转录酶组成，所述工作液的ph为8.3。

6、本发明还提供一种使用如上述的试剂盒从血液中分离提取检测aoc药物小核酸的方法，包括以下步骤：

7、s1.收集全血于edta抗凝管中，4℃1500g离心15min，收集血浆-80℃冰箱保存；

8、s2.取s1中的血浆，按照1：4的比例加入所述裂解液ⅰ；

9、s3.加入所述裂解液ⅱ，混匀后55℃孵育30分钟，然后95℃变性10分钟，随后冰上迅速冷却；

10、s4.4℃4000g离心20分钟，取上清稀释10倍；

11、s5.将上清加入到逆转录反应体系中进行逆转录，之后以逆转录得到的核酸片段为模板进行qpcr反应，得到ct值结果；

12、s6.使用pbs稀释aoc药物，从最高浓度点4倍梯度稀释，10个浓度点，之后将各浓度点的稀释液按s2-s5的步骤操作，得到各浓度点的稀释液的ct值结果，根据各浓度点和对应的ct值结果绘制标准曲线；

13、s7.将s5得到的ct值代入s6制备的标准曲线中，得到aoc药物小核酸的浓度。

14、进一步的，所述逆转录反应体系包括10μl工作液、50nm antisense stem-loop茎环逆转录引物，最后ddh2o补足到10μl；所述逆转录的反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃5min；所述逆转录采用的antisense stem-loop茎环逆转录引物的序列组成为gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacattccta(seq id no.1)。

15、进一步的，所述s5和s6中qpcr反应体系为：5μl 1x taqman universal pcrmaster mix、0.2mm antisense probe、1.5mm antisense f、0.7mm reverse和1μl模板，最后ddh2o补足到10μl；qpcr反应的程序为：95℃处理10分钟后进入循环：95℃处理15秒，60℃处理1分钟，共40个循环；所述qpcr采用的antisense f的序列组成为gcgcataaaatctacagtca(seq id no.2)，reverse的序列组成为gtgcagggtccgaggt(seq idno.3)，antisense probe的序列组成为fam-cgcactggatacgacattcc-mgb(seq id no.4)。

16、本发明还提供一种如上述的试剂盒在分离提取检测血液中的aoc药物小核酸的用途。

17、进一步的，使用qpcr技术检测aoc药物小核酸的浓度以评估aoc药物的药效。

18、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

19、本发明提供一种从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，利用本发明的试剂盒分离小核酸，先加入裂解液ⅰ，释放出细胞内抗体偶联的小核酸或多肽偶联的小核酸或小核酸，再加入裂解液ⅱ，裂解液ⅱ的蛋白酶k能切割aoc药物的蛋白端，将抗体与小核酸分离，同时进行高温处理，高温会破坏双链的氢键，将反义链和正义链分开，将蛋白酶k和高温处理相结合，能够充分分离出反义链，解决使用传统的方法会将抗体上偶联的小核酸去除，难以将aoc药物上的小核酸分离提取出来的技术问题，之后加入工作液，将分离的小核酸进行逆转录，之后采用qpcr技术即可将小核酸的含量检测出来。使用本发明的试剂盒不仅操作简单、成本低，而且分离的小核酸质量好，提高了aoc药物在血液中的分离效率，具有广泛的应用场景和推广价值。本发明还提供了使用该试剂盒从血液中分离提取aoc药物小核酸并与qpcr联用测量aoc药物小核酸的方法，能够对aoc药物小核酸的浓度进行定量，从而能够评估aoc药物的药效。

技术特征：

1.一种从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，其特征在于，包括裂解液ⅰ、裂解液ⅱ和工作液，所述裂解液ⅰ包括0.05-0.09m磷酸盐缓冲液、0.5-1.5m氯化钠和0.1-0.4％tritonx-100，所述裂解液ⅰ的ph为6.0-7.0，所述裂解液ⅱ包括50-150μg/ml蛋白酶k、20-80mm tris-hcl和7-13nm氯化钙，所述裂解液ⅱ的ph为7.0-8.0，所述工作液包括200-300mmtris-hcl、350-400mm氯化钾、10-20nm氯化镁、0.05-0.15m dtt、20-60u/μl rnase抑制剂和0.5-5u逆转录酶，所述工作液的ph为8.0-8.6。

2.如权利要求1所述的从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液ⅰ由0.07m磷酸盐缓冲液、1m氯化钠和0.25％tritonx-100组成，所述裂解液ⅰ的ph为6.5。

3.如权利要求1所述的从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述裂解液ⅱ由125μg/ml蛋白酶k、50mm tris-hcl和10nm氯化钙组成，所述裂解液ⅱ的ph为7.5。

4.如权利要求1所述的从血液中分离提取aoc药物小核酸的试剂盒，其特征在于，所述工作液由250mm tris-hcl、375mm氯化钾、15nm氯化镁、0.1m dtt、40u/μl rnase抑制剂和1u逆转录酶组成，所述工作液的ph为8.3。

5.一种使用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒从血液中分离提取检测aoc药物小核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述逆转录反应体系包括10μl工作液、50nmantisense stem-loop茎环逆转录引物，最后ddh2o补足到10μl；所述逆转录的反应条件为16℃30min，42℃30min，85℃5min；所述逆转录采用的antisense stem-loop茎环逆转录引物的序列组成为gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacattccta。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述s5和s6中qpcr反应体系为：5μl 1xtaqman universal pcr master mix、0.2mm antisense probe、1.5mm antisense f、0.7mmreverse和1μl模板，最后ddh2o补足到10μl；qpcr反应的程序为：95℃处理10分钟后进入循环：95℃处理15秒，60℃处理1分钟，共40个循环；所述qpcr采用的antisense f的序列组成为gcgcataaaatctacagtca，reverse的序列组成为gtgcagggtccgaggt，antisense probe的序列组成为fam-cgcactggatacgacattcc-mgb。

8.如权利要求1-4任一项所述的试剂盒在分离提取检测血液中的aoc药物小核酸的用途。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，使用qpcr技术检测aoc药物小核酸的浓度以评估aoc药物的药效。

技术总结
本发明适用于分子生物学技术领域，提供一种从血液中分离提取AOC药物小核酸的试剂盒，包括裂解液Ⅰ、裂解液Ⅱ和工作液，所述裂解液Ⅰ包括0.05‑0.09M磷酸盐缓冲液、0.5‑1.5M氯化钠和0.1‑0.4％TritonX‑100，所述裂解液Ⅰ的pH为6.5，所述裂解液Ⅱ包括50‑150μg/ml蛋白酶K、20‑80mM Tris‑HCl和7‑13nM氯化钙，所述裂解液Ⅱ的pH为7.5，所述工作液包括200‑300mM Tris‑HCl、350‑400mM氯化钾、10‑20nM氯化镁、0.05‑0.15M DTT、20‑60u/μL RNase抑制剂和0.5‑5U逆转录酶，所述工作液的pH为8.3。本发明还提供一种使用该试剂盒分离提取并测量AOC药物小核酸的方法。使用本发明的试剂盒分离的小核酸质量好、成本低而且操作简单。提高了AOC药物在血液中的分离效率，具有广泛的应用场景和推广价值。

技术研发人员：盛飞
受保护的技术使用者：迦进生物医药（上海）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14