一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用与流程

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用。

背景技术：

1、前列腺癌是在男性中发病率和死亡率均很高的恶性肿瘤之一，对男性健康造成了严重威胁。我国近十几年来，前列腺癌的发病率逐年上升；虽然对前列腺癌的早期诊断水平和治疗措施已经得到了很大提高，但晚期前列腺癌患者愈后仍然会有复发的危险，因此对前列腺癌的治疗一直是医疗工作者的研究焦点。homo sapiens ribosomal protein l7a(rpl7a，ncbi reference sequence：nm-000972.3)属于核糖体蛋白质l7ae家族，该基因可与trk原癌基因重排，形成嵌合癌基因trk-2h；目前，该基因被证实对前列腺癌细胞的发展也密切相关；确定前列腺癌的特异性基因，明确其表达状态，并针对该基因研制和开发药物制剂，有效的提高前列腺癌的治疗效率，减少药物的毒副作用，具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种用于前列腺癌的慢病毒。针对目的基因序列，根据rnai序列设计原则，确定了一种慢病毒的rnai靶点序列。

2、所述慢病毒的rnai靶点序列选自seq id no.1～seq id no.3中的任一种，其中：

3、seq id no.1的片段编码序列为：gaagaagcaggaggctaagaa；

4、seq id no.2的片段编码序列为：ctcctgcgattaaccagttca；

5、seq id no.3的片段编码序列为：caaagcaagagaagaagcaga。

6、在一种优选的实施方式中，所述慢病毒的rnai靶点序列选自seq id no.1。

7、进一步地，本申请将上述靶点序列构建到相应的慢病毒载体上，提供了一种慢病毒载体质粒；其制备步骤包括：

8、(1)选择工具载体，获取目的基因片段；

9、(2)合成单链引物和oligo dna；

10、(3)将oligo dna和线性化的工具载体连接后转化；

11、(4)菌落pcr鉴定、测序、质粒抽提；

12、所述步骤(1)中，选择br-v108作为工具载体，所述目的基因片段的核心序列为gaagaagcaggaggctaagaa。

13、所述步骤(2)中，单链引物包含以下序列：

14、5’-ccggcaaagcaagagaagaagcagactcgagtctgcttcttctcttgct ttgtttttg-3’和

15、5’-aattcaaaaacaaagcaagagaagaagcagactcgagtctgcttcttctcttgct ttg-3’。

16、所述引物退火形成oligo dna，所述oligo dna包含以下序列：

17、上游链：

18、5’-ccggcaaagcaagagaagaagcagactcgagtctgcttcttctcttgctttgt ttttg-3’；

19、下游链：

20、5’-aattcaaaaacaaagcaagagaagaagcagactcgagtctgcttcttctcttgct ttg-3’。

21、所述制备步骤(3)中需对工具载体进行酶切，酶切位点为ecor i和age i，将酶切后的工具载体与oligo dna在反应体系中反应1-3h后，将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中进行转化。

22、所述菌落pcr鉴定中，鉴定引物-f序列为

23、cctatttcccatgattccttcata，鉴定引物-r序列为

24、gtaatacggttatccacgcg。

25、其次，本发明提供了一种所述慢病毒的制备方法，所述的慢病毒由上述慢病毒载体质粒、pspax2载体质粒和pmd2g载体质粒三质粒共转染293t细胞制成。

26、所述慢病毒的制备步骤包括：(1)转染前12-18h，用胰蛋白酶消化对数生长期的293t细胞，用含10％fbs的培养基调整细胞密度约(4.5-6)×106/15ml，重新接种于10cm细胞培养皿中，在培养箱内培养。待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；

27、(2)转染前2h时细胞培养基更换为无血清培养基；

28、(3)在opti-mem r1培养基中加入各dna 溶液，室温静置；在另一opti-mem r1培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂dyb3893，室温静置；将两者轻柔混匀并在室温下静置；

29、(4)混合液滴加至293t细胞培养液中，放置细胞培养箱中培养；

30、(5)收集转染后48h、72h的细胞上清液。

31、所述dna溶液中慢病毒载体质粒8-12μg、pmd2.g载体质粒6-9μg、pspax2载体质粒3-7μg。

32、所述慢病毒载体系统的宿主细胞可选择为pc-3、22rv1、du 145、c4-2、ln cap中的一种或几种。

33、所述慢病毒可用于抑制前列腺癌细胞的增殖过程，在治疗前列腺癌的药物中使用。

34、有益效果

35、本发明针对前列腺癌提供了一种慢病毒，针对目的基因设计了合适的rnai靶点序列和oligo dna双链序列，并构建了包含上述oligo dna双链序列的慢病毒载体质粒和最终形成的慢病毒；慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因rpl7a的mrna表达量，敲减作用非常明显，对前列腺癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，可用于治疗前列腺癌的药物中，并且本发明可高通量操作、可重复性高。

技术特征：

1.一种用于前列腺癌的慢病毒，其特征在于，慢病毒的rnai靶点序列选自seq id no.1～seq id no.3中的任一种；其中：

2.根据权利要求1所述的慢病毒，其特征在于，慢病毒载体质粒的制备步骤包括：

3.根据权利要求2所述的慢病毒，其特征在于，选择br-v108作为工具载体。

4.根据权利要求3所述的慢病毒，其特征在于，所述单链引物包含以下序列：5’-ccggcaaagcaagagaagaagcagactcgagtctgcttcttctcttgctttgt ttttg-3’和

5.根据权利要求4所述的慢病毒，其特征在于，所述oligo dna包含以下序列：上游链：

6.根据权利要求5所述的慢病毒，其特征在于，所述制备步骤(3)中需对工具载体进行酶切，酶切位点为ecor i和age i。

7.根据权利要求2-6所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，由慢病毒载体质粒、pspax2载体质粒和pmd2g载体质粒三质粒共转染293t细胞制成。

8.根据权利要求7所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，制备步骤包括：在opti-memr1培养基中加入各dna 溶液，室温静置；在另一opti-mem r1培养基中加入对应质量的懿贝瑞转染试剂dyb3893，室温静置；将两者轻柔混匀并在室温下静置。

9.根据权利要求8所述的慢病毒的制备方法，其特征在于，所述dna溶液中慢病毒载体质粒8-12μg、pmd2.g载体质粒6-9μg、pspax2载体质粒3-7μg。

10.根据权利要求1-9任一项所述的慢病毒的应用，其特征在于，所述慢病毒用于抗前列腺癌的药物中。

技术总结
本申请涉及一种用于前列腺癌的慢病毒及其制备方法和应用，其中慢病毒的RNAi靶点序列选自GAAGAAGCAGGAGGCTAAGAA、CTCCTGCGATTAACCAGTTCA、CAAAGCAAGAGAAGAAGCAGA中的任意一种，本申请人在上海自然基金支持下(项目编号19ZR1454800)通过上述靶点序列构筑了oligo DNA双链序列和包含上述oligo DNA双链序列的慢病毒载体质粒并最终形成慢病毒，慢病毒中带有的抗性基因可有效降低目的基因RPL7A的mRNA表达量，对前列腺癌细胞的细胞增殖和细胞迁移具有较高的抑制效率，本发明制备的慢病毒可用于治疗前列腺癌的药物中。

技术研发人员：王飞飞
受保护的技术使用者：上海懿贝瑞生物医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14