一种前列腺癌类器官的培养基体系及培养方法与流程

本发明涉及生物，具体而言，涉及一种前列腺癌类器官的培养基体系及培养方法。

背景技术：

1、目前的前列腺癌培养基更多的是通过加入fbs血清的方式进行培养，对类器官的代谢组学影响较大。

2、上述培养方式引入了动物源性成分，也易造成药敏测试的假阳性结果。此外，对前列腺癌组织样本的原代细胞提取和类器官培养方法，目前是空缺的。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是提供一种前列腺癌类器官的培养基体系及培养方法。

2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

3、本发明提供一种前列腺癌类器官的培养基体系，所述培养基体系包括成球培养基和分化培养基；

4、所述成球培养基包括advanced dmem/f12基础培养基、b27、l-谷氨酰胺、r-spondin-1重组蛋白、noggin蛋白、fgf basic、fgf-10、egf、rock抑制剂y-27632、a83-01、p38mapk抑制剂sb202190、烟酰胺、肝细胞生长因子；还包括wnt 3a细胞因子、硫酸酯酶2重组蛋白；

5、所述分化培养基包括所述成球培养基和分化培养添加剂；所述分化培养基添加剂包括氯化锌和亚精胺。

6、进一步，所述成球培养基和所述分化培养基中均还包括双氢睾酮和pge2。

7、进一步，所述成球培养基和所述分化培养基中均还包括ph缓冲液、抗菌剂和抗氧化剂；所述ph缓冲液为hepes，所述抗菌剂为primocin抗生素，所述氧化剂为n-乙酰半胱氨酸。

8、进一步，所述成球培养基中，hepes的浓度为5-10mm、b27的浓度为1×、l-谷氨酰胺的浓度为1×、r-spondin-1重组蛋白的浓度为100-200ng/ml、noggin蛋白的浓度为50-100ng/ml、fgf basic的浓度为1-2ng/ml、fgf-10的浓度为10-20ng/ml、egf的浓度为50-100ng/ml、rock抑制剂y-27632的浓度为10-20μm、a83-01的浓度为0.5-2μm、双氢睾酮的浓度为1-2nm、primocin抗生素的浓度为50-100μg/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为10-20μm、烟酰胺的浓度为10-20mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1-2mm、pge2的浓度为1-2μm、wnt3a细胞因子的浓度为10-20

9、ng/ml、肝细胞生长因子的浓度为50-100ng/ml、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为5-10ng/ml；溶剂为advanced dmem/f12基础培养基。

10、进一步，hepes的浓度为10mm、r-spondin-1重组蛋白的浓度为125ng/ml、noggin蛋白的浓度为100ng/ml、fgf basic的浓度为1ng/ml、fgf-10的浓度为20ng/ml、egf的浓度为50ng/ml、rock抑制剂y-27632的浓度为10μm、a83-01的浓度为0.5μm、双氢睾酮的浓度为1nm、primocin抗生素为100μg/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为10μm、烟酰胺的浓度为10mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mm、pge2的浓度为1μm、wnt 3a细胞因子的浓度为10ng/ml、肝细胞生长因子的浓度为50ng/ml、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为5ng/ml；溶剂为advanced dmem/f12基础培养基。

11、进一步，所述分化培养基中，氯化锌的浓度为10-20mg/l，亚精胺的浓度为5-10mm。

12、进一步，所述分化培养基中，氯化锌的浓度为10mg/l，亚精胺的浓度为5mm。

13、本发明还提供一种前列腺癌类器官的培养方法，采用如上述的培养基体系进行培养；其中，先在所述成球培养基中对病灶组织样本进行培养，再向培养液中添加所述分化培养基继续培养。

14、进一步，包括以下步骤：

15、s1、获取待培养的前列腺组织样本并进行前处理，得到病灶组织样本；

16、s2、对所述病灶组织样本依次进行消化、重悬、过滤、离心后，收集细胞沉淀；

17、s3、将所述细胞沉淀重悬于基质胶中，再进行滴胶接种，接种完成后，静置直至所述胶滴全凝固；

18、s4、在每个所述胶滴上加入预热后的所述成球培养基，

19、s5、培养4天后，在每个所述胶滴上添加所述分化培养基，培养7～14天后，得到所述前列腺癌类器官。

20、进一步，所述步骤s3中，进行滴胶接种时，每个所述胶滴的体积为50μl，所述步骤s4中，每个所述胶滴上加入500μl预热后的所述成球培养基，再并使用dpbs-ps进行封边处理。

21、本发明的有益效果为：

22、(1)本发明的前列腺癌类器官的培养基体系，其中添加关键因子wnt-3a和sulf2后，由于wnt-3a和sulf2结合后诱导经典wnt通路的激活，从而提高前列腺癌类器官的增殖、侵袭迁移、以及抗凋亡能力；

23、(2)本发明的前列腺癌类器官的培养基体系，在分化培养阶段特异性加入氯化锌10mg/l和低浓度亚精胺5mm，可以保护上皮细胞和基质细胞，更好的保留肿瘤异质性；

24、(3)本发明的前列腺癌类器官的培养基体系，成球培养基和分化培养基中均还包括双氢睾酮(dihydrotestosterone，dht)和pge2；dht是在前列腺组织中高度富集的激素因子，可促进前列腺细胞增殖；peg2是环氧合酶2(cox-2)途径的产物，能够刺激肿瘤细胞增殖和保护肿瘤细胞凋亡来支持肿瘤生长，对于前列腺癌类器官的增殖和自组装非常关键；

25、(4)本发明的前列腺癌类器官的培养方法，将前列腺癌类器官的培养过程分为成球阶段和分化阶段；在成球后，由于上皮细胞、基质细胞和癌症组织代谢存在明显差异，在分化阶段特异性的加入氯化锌和低浓度亚精胺，可以保护上皮细胞和基质细胞，更好的保留肿瘤异质性。

26、(5)本发明的前列腺癌类器官的培养方法，前列腺癌类器官在培养过程中具有更高的细胞增殖速度，同时还具有更高的细胞活率，得到的前列腺癌类器官的质量更优。

技术特征：

1.一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述培养基体系包括成球培养基和分化培养基；

2.根据权利要求1所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述成球培养基还包括双氢睾酮和pge2。

3.根据权利要求2所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述成球培养基还包括ph缓冲液、抗菌剂和抗氧化剂；所述ph缓冲液为hepes，所述抗菌剂为primocin抗生素，所述氧化剂为n-乙酰半胱氨酸。

4.根据权利要求3所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述成球培养基中，hepes的浓度为5-10mm、b27的浓度为1×、l-谷氨酰胺的浓度为1×、r-spondin-1重组蛋白的浓度为100-200ng/ml、noggin蛋白的浓度为50-100ng/ml、fgf basic的浓度为1-2ng/ml、fgf-10的浓度为10-20ng/ml、egf的浓度为50-100ng/ml、rock抑制剂y-27632的浓度为10-20μm、a83-01的浓度为0.5-2μm、双氢睾酮的浓度为1-2nm、primocin抗生素的浓度为50-100μg/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为10-20μm、烟酰胺的浓度为10-20mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1-2mm、pge2的浓度为1-2μm、wnt 3a细胞因子的浓度为10-20ng/ml、肝细胞生长因子的浓度为50-100ng/ml、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为5-10ng/ml；溶剂为advanced dmem/f12基础培养基。

5.根据权利要求4所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，hepes的浓度为10mm、r-spondin-1重组蛋白的浓度为125ng/ml、noggin蛋白的浓度为100ng/ml、fgfbasic的浓度为1ng/ml、fgf-10的浓度为20ng/ml、egf的浓度为50ng/ml、rock抑制剂y-27632的浓度为10μm、a83-01的浓度为0.5μm、双氢睾酮的浓度为1nm、primocin抗生素为100μg/ml、p38mapk抑制剂sb202190的浓度为10μm、烟酰胺的浓度为10mm、n-乙酰半胱氨酸的浓度为1.25mm、pge2的浓度为1μm、wnt 3a细胞因子的浓度为10ng/ml、肝细胞生长因子的浓度为50ng/ml、硫酸酯酶2重组蛋白的浓度为5ng/ml；溶剂为advanced dmem/f12基础培养基。

6.根据权利要求4所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述分化培养基中，氯化锌的浓度为10-20mg/l，亚精胺的浓度为5-10mm。

7.根据权利要求4所述一种前列腺癌类器官的培养基体系，其特征在于，所述分化培养基中，氯化锌的浓度为10mg/l，亚精胺的浓度为5mm。

8.一种前列腺癌类器官的培养方法，其特征在于，采用如权利要求1～7任意一项所述的培养基体系进行培养；其中，先在所述成球培养基中对病灶组织样本进行培养，再向培养液中添加所述分化培养基继续培养。

9.根据权利要求8所述一种前列腺癌类器官的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

10.根据权利要求9所述一种前列腺癌类器官的培养方法，其特征在于，所述步骤s3中，进行滴胶接种时，每个所述胶滴的体积为50μl，所述步骤s4中，每个所述胶滴上加入500μl预热至37℃的所述成球培养基，再并使用dpbs-ps进行封边处理。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种前列腺癌类器官的培养基体系及培养方法。该培养基体系包括成球培养基和分化培养基；成球培养基包括Advanced DMEM/F12基础培养基、B27、L‑谷氨酰胺、R‑Spondin‑1重组蛋白、Noggin蛋白、FGF basic、FGF‑10、EGF、ROCK抑制剂Y‑27632、A83‑01、p38MAPK抑制剂SB202190、烟酰胺、肝细胞生长因子；还包括Wnt 3a细胞因子、硫酸酯酶2重组蛋白；分化培养基包括成球培养基和分化培养添加剂；分化培养基添加剂包括氯化锌和亚精胺。该培养基体系中的Wnt‑3a和SULF2能提高前列腺癌类器官的增殖、侵袭迁移、以及抗凋亡能力；氯化锌和亚精胺可更好的保留肿瘤异质性；该培养方法具有更高的细胞增殖速度和细胞活率，得到的前列腺癌类器官的质量更优。

技术研发人员：游明亮,蔡超杰,邢华杨
受保护的技术使用者：杭州艾名医学科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13