一种米卡芬净中间体FR901379高产菌株及其应用的制作方法

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种产米卡芬净中间体fr901379的高产菌株及其制备方法和应用。

背景技术：

1、fr901379是合成米卡芬净类药的重要前体物质，通过脱酰化作用后得到米卡芬净母核fr179642，米卡母核化学合成得到的新型棘白菌素类抗真菌药物米卡芬净；它对念珠菌如白念珠菌、光滑念珠菌、热代念珠菌、克柔念珠菌和近平滑念珠菌有较好的抑制活性，对于曲霉也有良好的体外抑制活性，但对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。

2、米卡芬净(micafungin)商品名为fungusrd，可以用于治疗食道念珠菌感染、骨髓移植及ads患者中性粒细胞减少症的预防治疗。

3、

4、fr901379可以通过发酵菌株进行生产。

5、中国专利cn202210496769.1中公开了一株高产fr901379的菌株，所述菌株为岩高兰鞘茎点霉(coleophoma empetri)h40-23，所述菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为cgmcc no.40075，保藏日期为2022年1月29日，该发明还提供了上述菌株在生产fr901379中的应用。该菌株fr901379产量为587.8mg/l，比对照菌株(365.2mg/l)高222mg/l，比诱变前提高了60.8％。但其产量对于实际生产仍有较大的提升空间。

6、中国专利cn201810536315.6中公开了一种fr179642的制备方法，该方法包括：1)发酵fr901379的培养基的制备；2)将菌株coleophoma empetri种子培养液接种于发酵培养基进行发酵；3)在发酵培养24-72h后，向发酵液中补加棕榈酸甲酯和二甲基硅油混合物；4)当发酵160h后，fr901379的浓度不再增长时，发酵结束；5)将上一步得到的fr901379与脱酰酶交联酶聚体反应，转化为fr179642。其方法中fr901379放罐浓度为3.40g/l。虽然fr901379产量有所提升，但其适用的培养基粘度会偏高，不利于溶氧传递。此外，该专利中的菌株发酵通过补加棕榈酸甲酯和二甲基硅油来提高fr901379的产素水平，使发酵成本增加且工艺更加复杂化。因此，获得更优良的种质资源对于fr901379的生产十分必要。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了提供了一种菌株hq-mk-011，通过对其进行发酵，可以大量生产fr901379，能够为米卡芬净类药的生产提供大量原料，解决临床需求问题。

2、一方面，本发明提供了一种菌株hq-mk-011。

3、所述的菌株hq-mk-011的拉丁学名为coleophoma empetri，保藏编号为cgmccno.40516，于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

4、所述的菌株hq-mk-011的菌落颜色为灰黑色，表面有凹痕。

5、另一方面，本发明提供了前述的菌株hq-mk-011在制备fr901379中的应用。

6、再一方面，本发明提供了一种生产fr901379的方法。

7、所述的方法中包括将权利要求1所述的菌株hq-mk-011接种于培养基后进行发酵。

8、具体地，所述的培养基为含有可同化的碳源和氮源的营养培养基。

9、优选地，所述的可同化碳源选自糊精、淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、乳糖、海藻糖、木糖醇、山梨醇之一或者上述物质的组合。

10、优选地，所述的可同化氮源选自大豆蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、花生饼粉、麸质粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、牛肉浸膏、酵母膏、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合。

11、优选地，所述的培养基中还包括无机盐，所述的无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸钙、硫酸锌、硫酸铵、氯化钙、硫酸铜之一或者组合。

12、具体地，所述的发酵为有氧发酵。

13、优选地，所述的有氧发酵的温度为22-30℃，优选为24-28℃；培养基ph4-9，优选为5-8；培养时间为144-264h，优选为168-240h。

14、进一步优选地，所述的营养培养基包括蔗糖5-30g/l、玉米淀粉10-50g/l、葡萄糖10-40g/l、山梨醇20-100g/l、麦芽糊精10-40g/l、棉籽饼粉5-30g/l、麸质粉10-50g/l、酵母粉10-40g/l、黄豆饼粉5-30g/l、碳酸钙1-10g/l、磷酸二氢钾2-10g/l、硫酸铵5-40g/l、硫酸镁1-5g/l、硫酸锰0.1-1g/l、硫酸亚铁0.1-1g/l、硫酸锌0.01-0.1g/l。

15、具体地，所述的菌株hq-mk-011先制备种子液再接种于培养基进行发酵。

16、所述的种子液由菌株hq-mk-011接种于种子培养基进行培养得到。

17、所述的种子培养基的组成可以是：可溶性淀粉10-40g/l、蔗糖10-40g/l、葡萄糖10-50g/l、棉籽饼粉10-50g/l、黄豆饼粉10-40g/l、磷酸二氢钾1-5g/l、碳酸钙1-8g/l。

18、所述的种子液的培养温度22-30℃，优选为23-28℃；培养基ph4-9，优选为ph5-8；培养时间32-64h，优选为培养时间为40-54h。

19、优选地，所述方法中包括：将菌株hq-mk-011在固体培养中进行菌落培养，然后接种于种子培养基进行种子培养，再移种于发酵培养基进行发酵培养。

20、本发明同时提供了前述的菌株hq-mk-011的发酵液。

21、所述的发酵液可以通过上述的方法制备得到。

22、本发明菌株hq-mk-011与现有技术中fr901379产生菌相比具有以下优点：

23、(1)本发明菌株hq-mk-011为诱变得到的高产菌株，发酵单位较高，且能稳定生产f901379。

24、(2)通过本发明菌株hq-mk-011得到的发酵液，粘度明显减少，有利于溶氧的传递，使得发酵罐得到相同产量的周期明显缩短，相同周期的发酵单位明显提高，最高可达4g/l。

25、(3)通过本发明菌株的得到的发酵液的杂质比例下降，使下游提取工艺成本减少，有利于工业化生产。

26、保藏说明

27、菌株名称：hq-mk-011；

28、拉丁学名：coleophoma empetri；

29、保藏编号：cgmcc no.40516；

30、保藏时间：2023年03月06日；

31、保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)；

32、保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

技术特征：

1.一种菌株hq-mk-011，其特征在于，拉丁学名为colephoma empetri，保藏编号为cgmcc no.40516。

2.权利要求1所述的菌株hq-mk-011在制备fr901379中的应用。

3.一种生产fr901379的方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的菌株hq-mk-011接种于培养基后进行发酵。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的培养基为含有可同化的碳源和氮源的营养培养基。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的发酵为有氧发酵。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的可同化碳源选自糊精、淀粉、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖、甘油、乳糖、海藻糖、木糖醇、山梨醇之一或者上述物质的组合。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的可同化氮源选自大豆蛋白胨、酵母蛋白胨、酵母粉、酵母抽提物、黄豆饼粉、花生饼粉、麸质粉、棉籽饼粉、玉米浆干粉、牛肉浸膏、酵母膏、尿素、铵盐之一或者上述物质的组合。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的培养基中还包括无机盐，所述的无机盐选自柠檬酸三钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、氯化钾、硫酸镁、硫酸亚铁、碳酸钙、硫酸锌、硫酸铵、氯化钙、硫酸铜之一或者组合。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在在于，所述的有氧发酵的温度为22-30℃，培养基ph4-9，培养时间为144-264h。

10.根据权利要求3-9任一项所述的方法，其特征在于，所述的营养培养基包括蔗糖5-30g/l、玉米淀粉10-50g/l、葡萄糖10-40g/l、山梨醇20-100g/l、麦芽糊精10-40g/l、棉籽饼粉5-30g/l、麸质粉10-50g/l、酵母粉10-40g/l、黄豆饼粉5-30g/l、碳酸钙1-10g/l、磷酸二氢钾2-10g/l、硫酸铵5-40g/l、硫酸镁1-5g/l、硫酸锰0.1-1g/l、硫酸亚铁0.1-1g/l、硫酸锌0.01-0.1g/l。

技术总结
本发明提供一种菌株HQ‑MK‑011，拉丁学名为Colephoma empetri，保藏编号为CGMCC No.40516，于2023年03月06日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本发明菌株HQ‑MK‑011为诱变得到的高产菌株，发酵单位较高，且能稳定生产FR901379。通过本发明菌株HQ‑MK‑011得到的发酵液粘度明显减少，有利于溶氧的传递，使得发酵罐得到相同产量的周期明显缩短，相同周期的发酵单位明显提高，最高可达约4g/L。通过本发明菌株的得到的发酵液的杂质比例下降，使下游提取工艺成本减少，有利于工业化生产。

技术研发人员：蒋兴,韩双,许江丽,陈仁清,陈峰,陈志文
受保护的技术使用者：浙江昊清生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13