指状青霉致病性基因PdGpaA及用途

本发明属于微生物基因工程，具体涉及一种来源于指状青霉的致病性基因pdgpaa及其用途。

背景技术：

1、柑橘作为世界第一大类的水果和第三大贸易农产品，主要用于经济栽培的是枳、柑橘和金柑三大属。2021年，全球柑橘产量约为1.585亿吨，其中中国的产量位居首位占全球总产量的28％，约为4460万吨。中国的柑橘主要以鲜销为主，但在柑橘采后的采摘、包装、储藏、运输和销售过程中，容易发生霉变和腐烂，造成不可估计的经济损失。其中由指状青霉(penicillium digitatum)引起的绿霉病，是柑橘采后普遍发生、危害严重且直接造成经济损失的主要病害，因此绿霉病是防治的重中之重。指状青霉是一种腐生真菌，广泛存在于果园的树叶、落果以及空气中。另一方面，作为一种坏死性病原体，指状青霉的寄主范围相对较窄，主要感染成熟的柑橘类水果，潜在机制可能很复杂，至今尚未确定。目前，我国预防柑橘采后病害主要采用化学杀菌剂，如：咪鲜胺、邻苯基苯酚钠、噻苯咪唑、嘧霉胺等。化学杀菌剂具有高效、广谱和使用方便等优势，然而，其安全性问题备受社会关注。

2、指状青霉产孢量极大，并且容易扩散，在经过了合适的温度和雨水扩散后，指状青霉通过识别寄主，在伤口处扎根发芽，在短时间内分泌酸性物质改变环境ph，与此同时，细胞壁降解酶也处在一个较高的水平，导致柑橘果实腐烂变软。

3、在所有丝状真菌中，几丁质是细胞壁的重要组成部分，钙荧光白(cfw)可以和几丁质特异性结合，影响几丁质与β-1,3-和β-1,6-葡聚糖过程的连接，细胞壁中还存在少量的β-葡聚糖，刚果红(cr)可以和β-1,3葡聚糖结合相互作用，导致细胞壁损伤，破坏指状青霉细胞壁的正常组装。细胞壁完整性会严重影响真菌的生长发育，对真菌侵染宿主也有极大的影响。

4、鉴定、克隆植物病原真菌的致病基因，尤其是与侵入过程相关的基因，可以为设计、筛选抗真菌药物提供更多有用的新靶点。因此，通过研究指状青霉致病的分子机制，利用分子生物学技术鉴定、克隆新的在指状青霉的致病过程中具有重要功能的致病性基因，为设计筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点，从而开发、设计出新型的抗真菌药物。目前已有一些药物靶点被发现，例如三环唑(稻瘟病菌抗菌剂)，其作用机制是抑制黑色素合成，针对的靶点是稻瘟病菌的三羟萘还原酶。因此，利用分子生物学技术鉴定和克隆指状青霉侵染过程中具有重要功能的致病性基因，可以为设计和筛选新的抗真菌药物提供有用的药物靶点。

技术实现思路

1、本发明提供了一种指状青霉致病性基因pdgpaa，该基因的cdna序列如seq idno.1所示，基因pdgpaa编码蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

2、基因pdgpaa或其编码蛋白在调控指状青霉生长或产孢量或孢子梗形成或孢子萌发率或胚芽管长度中的应用：在本发明的具体实施例中，与指状青霉野生型相比，δpdgpaa缺失突变体的菌落生长直径减慢，并且菌落边缘出现明显的白色菌丝体，总的孢子产量显著下降，同时pdgpaa基因敲除后，在短时间内孢子的萌发率和胚芽管伸长长度高于野生型，但δpdgpaa突变体的孢子梗形成会延缓，因此整体会造成孢子产量减少。

3、基因pdgpaa或其编码蛋白在调控指状青霉致病性中的应用：在本发明的具体实施例中，将δpdgpaa缺失突变体接种在“纽荷尔”脐橙，δpdgpaa突变体产生的病斑很小，只能看到接种孔处有白色的菌丝和较窄的水渍状病斑(8.62mm)，而野生菌n1的病斑达到了91.85mm，该实验结果表明pdgpaa参与了指状青霉对柑橘的致病过程，抑制或阻断该基因或者编码的蛋白的表达，指状青霉引起的绿霉病将显著抑制。

4、基因pdgpaa或其编码蛋白作为靶点在筛选或制备抗绿霉病药物中的应用：筛选和设计能够抑制或阻断该基因表达的化合物可作为新型防治绿霉病的杀菌剂。

5、与现有的技术相比，本发明的有益效果在于：

6、1、本发明提供的pdgpaa基因对指状青霉菌丝生长、孢子产量、细胞壁完整性、抗药性和致病性具有关键性作用，pdgpaa基因会影响细胞壁完整性，提高细胞壁几丁质的含量而降低葡聚糖含量，从而影响指状青霉的生长和发育，进而影响其致病性。

7、2、孢子的产量和极易扩散是绿霉病发生严重的重要原因之一，δpdgpaa突变体产孢量显著下降(9.69×107cfu/ml)，且生长慢(18.04mm)，δpdgpaa突变体接种柑橘后，病斑直径显著下降至8.62mm，只有野生菌的9.38％，因此抑制或阻断pdgpaa基因的表达可以有效控制绿霉病的发生。

8、3、pdgpaa基因为开发新型的抗绿霉病药物提供了特异的作用靶点，筛选和设计能够抑制或阻断该基因表达的化合物可作为新型防治绿霉病的杀菌剂，因此致病性基因pdgpaa在防治柑橘绿霉病中具有广阔的应用空间和前景。

技术特征：

1.指状青霉致病性基因pdgpaa，其特征在于，所述基因pdgpaa的cdna序列如seq idno.2所示。

2.权利要求1所述的基因pdgpaa编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.权利要求1所述的基因pdgpaa或权利要求2所述的蛋白在调控指状青霉产孢量或孢子梗形成或孢子萌发率或胚芽管长度中的应用。

4.权利要求1所述的基因pdgpaa或权利要求2所述的蛋白在调控指状青霉生长中的应用。

5.权利要求1所述的基因pdgpaa或权利要求2所述的蛋白在调控指状青霉致病性中的应用。

6.权利要求1所述的基因pdgpaa或权利要求2所述的蛋白作为靶点在筛选或制备抗绿霉病药物中的应用。

7.一种防治柑橘绿霉病的方法，其特征在于，包括抑制或阻断指状青霉pdgpaa基因的表达。

技术总结
本发明属于微生物技术领域，公开了一种指状青霉致病性基因PdGpaA及其应用，PdGpaA基因缺失菌株生长缓慢，产孢量下降，细胞壁完整性改变，对咪酰胺具有敏感性，∆PdGpaA突变体接种柑橘后，病斑直径显著下降至8.62 mm，仅为野生菌产生病斑直径的9.38%，因此通过抑制或阻断指状青霉PdGpaA基因的表达可有效控制绿霉病的发生，PdGpaA基因为开发新型的抗绿霉病药物提供了特异的作用靶点。

技术研发人员：龙超安,杜玉杰,田中欢,朱金帆,张婉,陈晓,杨凡
受保护的技术使用者：华中农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14