一种声波振动提高外泌体产量的方法

本发明涉及生物医学，具体涉及一种声波振动提高外泌体产量的方法。

背景技术：

1、外泌体是几乎所有类型细胞分泌的30-100nm直径范围内的细胞外囊泡，存在于细胞内多囊泡体，外泌体不仅参与了正常生理过程的调控，还能够通过调节肿瘤细胞和介质细胞之间的串扰来完成肿瘤的生成和转移。所以，外泌体成为了癌症检测中的新型生物标志物。外泌体检测以其不需要侵入性外科手术、体外液体活检的优势，成为了癌症诊断和临床检测的新兴手段。

2、然而，阻碍外泌体转化到临床应用的主要挑战之一在于其产量低，无法实现临床前和临床实验将需要的大规模且具有成本效益的生产方案。为了解决这一问题，已经探索了生物、化学和物理等方法以提高外泌体产量。例如，使用莫能菌素(mon)诱导细胞内ca2+的变化，或钾诱导的去极化导致ca2+的大量进入，刺激了细胞中外泌体的释放。除此之外，sitafloxacin, forskolin, sb218795, fenoterol, nitrefazole and pentetrazol这些药物也能激活外泌体的产生和释放。物理方法如热应力、缺氧和照射、ph值等都有报道研究证明可以增加外泌体的产量。遗憾的是，上述方法都存在缺点。添加诱导试剂和药物会产生细胞毒性，降低细胞活率，并且引入外来物质使得外泌体纯度降低，需要进一步提纯将操作过程复杂化。刺激性强的物理方法会使外泌体表面蛋白变性，可能直接影响外泌体的形态、性能，损害了其诊断和筛选的能力。由此可见，现有的细胞分泌外泌体产量提高方法操作复杂、实验条件苛刻、对细胞损害大，难以在短时间内产出大量外泌体，无法满足实际生产需要和工程应用需求。

3、因此，需要一种声波振动提高外泌体产量的方法。

技术实现思路

1、针对上述问题，本发明提供一种声波振动提高外泌体产量的方法，以解决现有的细胞分泌外泌体产量提高方法难以在短时间内产出大量外泌体的问题。

2、为解决该技术问题，本说明书提供了如下技术方案：

3、一种声波振动提高外泌体产量的方法，包括以下步骤：

4、对细胞进行传代培养；

5、判断细胞是否贴壁，若是，则弃去原培养液；清洗后用无外泌体胎牛血清培养细胞；

6、对采用无外泌体牛血清培养细胞过程中施加预设的低频正弦波声波，得到细胞培养液；

7、收集细胞培养液，离心后即得外泌体。

8、进一步的，所述低频正弦波声波的频率范围为50 hz～200 hz，振幅范围为20 μm-100 μm，施加时间为6 h-72 h。

9、进一步的，所述施加低频正弦波声波过程以如下制度依次进行：

10、频率为50 hz～100 hz，振幅为20 μm的声波6 h；

11、频率为100 hz～200 hz，振幅为40 μm的声波6 h；

12、频率为50 hz～100 hz，振幅为60 μm的声波6 h；

13、频率为100 hz～200 hz，振幅为80 μm的声波12 h；

14、频率为50 hz～100 hz，振幅为60 μm的声波6 h；

15、频率为100 hz～200 hz，振幅为40 μm的声波6 h；

16、频率为50 hz～100 hz，振幅为20 μm的声波6 h。

17、进一步的，所述施加低频正弦波声波方式如下：

18、将扬声器置于培养细胞器皿的下方；

19、控制扬声器持续播放频率和振幅符合设定要求；

20、判断扬声器播放时间是否达到预设时间阈值，若是，则收集细胞培养液。

21、进一步的，采用可移动数字终端控制扬声器播放频率、振幅和时间。

22、进一步的，所述离心处理过程如下：

23、以2000g的相对离心力对细胞培养液进行离心，得到去除细胞碎片和死细胞的上清；

24、以12000g的相对离心力对去除细胞碎片和死细胞的上清进行离心，得到去除微泡或蛋白聚集体的上清；

25、采用0.22μm过滤器对去除微泡或蛋白聚集体的上清进行过滤，得到去除凋亡小体和微泡的上清；

26、将所述去除凋亡小体和微泡的上清加入外泌体分离仪器中分离，得到外泌体。

27、进一步的，得到外泌体之后，还包括以下过程：

28、采用磷酸缓冲盐溶液洗涤外泌体，然后采用磷酸缓冲盐溶液冲洗重悬外泌体。

29、进一步的，细胞传代培养条件如下：

30、将细胞放入37℃的培养箱中，进行时长为24h的传代培养。。

31、进一步的，所述清洗细胞，过程如下：

32、采用磷酸缓冲盐溶液将细胞清洗两遍。

33、进一步的，所述细胞初始接种数量为5×105个细胞。

34、本发明的有益效果是：

35、通过采用特定振幅的低频正弦波持续刺激细胞一定时间，显著提高了外泌体产量，解决了传统外泌体产量提高方法效率低下、成本高昂、难以满足生产生活需要的问题，并且不伤害细胞、操作便捷、成本低廉、自动化程度高，适合进行工程化应用和推广。

技术特征：

1.一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2. 根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述低频正弦波声波的频率范围为50 hz～200 hz，振幅范围为20 μm-100 μm，施加时间为6 h-72h。

3.根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述施加低频正弦波声波过程以如下制度依次进行：

4.根据权利要求2或3所述的任一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述施加低频正弦波声波方式如下：

5.根据权利要求4所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，采用可移动数字终端控制扬声器播放频率、振幅和时间。

6.根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述离心处理过程如下：

7.根据权利要求6所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，得到外泌体之后，还包括以下过程：

8.根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，细胞传代培养条件如下：

9.根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述清洗细胞，过程如下：

10.根据权利要求1所述的一种声波振动提高外泌体产量的方法，其特征在于，所述细胞初始接种数量为5×105个细胞。

技术总结
本发明公开了一种声波振动提高外泌体产量的方法，包括以下步骤：对细胞进行传代培养；判断细胞是否贴壁，若是，则弃去原培养液，清洗后用无外泌体胎牛血清培养细胞；对采用无外泌体胎牛血清培养细胞过程中施加预设的低频正弦波声波，得到细胞培养液；收集细胞培养液，离心后即得外泌体。本发明通过采用特定振幅的低频正弦波振动刺激细胞一定时间，显著提高了细胞的外泌体产量，解决了传统外泌体产量提高方法效率低下、成本高昂、难以满足生产生活需要的问题。

技术研发人员：王书崎,雷倬玥,杜奇军,刘洁,刘慧,吴迪,武国华,颜小皓
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15