适用于模式蓝细菌聚球藻PCC7942的生物防逃逸系统及构建方法和应用

本发明涉及合成生物学所带来的生物安全领域，特别是涉及一种适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统及构建方法和应用，可解决工程蓝细菌带来的生物安全问题。

背景技术：

1、随着合成生物学近些年来的显著进步，许多领域也因此有了巨大的变化，并为人类社会带来巨大的收益。但与此同时，转基因微生物在自然界中的扩散问题可能会带来潜在的生物安全问题，对环境和人类造成不利影响。

2、光合蓝细菌是一种典型的光自养微生物，能够进行光合作用。经过基因工程改造，可以将光和二氧化碳转化为许多工业或商用相关的化学物质，包括生物燃料、材料和营养产品。目前，越来越多的研究致力于探究蓝细菌的合成生物学策略，这对实现国家“双碳”宏伟目标具有重要的价值。而随着转基因蓝细菌被越来越广泛的研究和应用，人类需要考虑工程蓝细菌所带来的生物安全问题并解决它们被有意或无意释放到自然环境中的潜在危害。

3、为了解决这一生物安全问题，研究者们已经在蓝细菌中开发了数种生物防逃逸策略，包括主动型和被动型。而现存的生物防逃逸系统还存在稳定性差、鲁棒性差或致死效率低等问题。比如对于被动型生物防逃逸系统而言，致死需要较长的时间，并且存在环境补给的风险；而对于现有的主动型生物防逃逸系统，严谨性较低，工程菌株在受控的条件下生长也会受到一定程度的抑制。因此，亟需一种在蓝细菌中建立致死率高且非常严谨的生物防逃逸系统。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统。

2、本发明的第二个目的是提供适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统的构建方法。

3、本发明的第三个目的是提供适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统的应用。

4、本发明的技术方案概述如下：

5、适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统的构建方法，包括如下步骤：

6、(1)通过基因合成获得启动子pr基因和阻遏蛋白ci857基因；从集胞藻pcc 6803中获得抗毒素ssr1114基因以及启动子ppsba2基因；从游离型质粒pja2中扩增得到终止子trrnb基因；从整合型质粒psⅲ-cm中获得终止子trbcl基因；

7、所述pr基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；

8、所述ci857基因的核苷酸序列如seq id no.2所示；

9、所述ssr1114基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；

10、所述ppsba2基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；

11、所述trrnb基因的核苷酸序列如seq id no.8所示；

12、所述trbcl基因的核苷酸序列如seq id no.7所示；

13、(2)以psⅲ-cm为载体，用启动子pr基因表达抗毒素ssr1114基因，用终止子trrnb基因终止转录；用启动子ppsba2基因表达阻遏蛋白ci857基因，用终止子trbcl基因终止转录；构建质粒nsⅲ-pr-ssr1114-trrnb-ppsba2-ci857-trbcl；

14、(3)从集胞藻pcc 6803中获得毒素slr0664基因和启动子pcpc560基因；从游离型质粒pja2中扩增得到终止子trrnb基因；

15、所述slr0664基因的核苷酸序列如seq id no.5所示；

16、所述pcpc560基因的核苷酸序列如seq id no.6所示；

17、(4)以pja2为载体，用启动子pcpc560基因表达毒素slr0664基因，用终止子trrnb基因终止转录，构建质粒pja-pcpc560-slr0664-trrnb；

18、(5)将所述质粒nsⅲ-pr-ssr1114-trrnb-ppsba2-ci857-trbcl转入聚球藻pcc 7942中，得到工程菌株mjj-01；将所述质粒pja-pcpc560-slr0664-trrnb转入工程菌株mjj-01中，得到简称为工程菌株mjj-02的适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统。

19、上述的方法构建的适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统。

20、上述适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统在生物防逃逸中的应用。

21、有益效果：

22、本发明通过基因工程改造，构建了适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统，使得工程菌株在实验室培养条件下可正常生长，而逃逸到低温(33℃及以下)的环境中时启动“自杀开关”使工程菌株迅速死亡，避免工程菌株逃逸到环境中。并且可应用于代谢工程蓝细菌菌株中，可作为“蓝细菌细胞工厂”的细胞底盘。这对蓝细菌合成生物学研究和应用的健康发展有极其重要的价值，为蓝细菌的生物安全提供了有效的解决方案。

技术特征：

1.适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

2.权利要求1所述的方法构建的适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统。

3.权利要求2所述适用于模式蓝细菌聚球藻pcc 7942的生物防逃逸系统在生物防逃逸中的应用。

技术总结
本发明公开了适用于模式蓝细菌聚球藻PCC 7942的生物防逃逸系统及构建方法和应用，构建：构建质粒NSⅢ‑P<subgt;R</subgt;‑ssr1114‑T<subgt;rrnB</subgt;‑P<subgt;psbA2</subgt;‑cI857‑T<subgt;rbcl</subgt;和质粒pJA‑P<subgt;cpc560</subgt;‑slr0664‑T<subgt;rrnB</subgt;；将质粒NSⅢ‑P<subgt;R</subgt;‑ssr1114‑T<subgt;rrnB</subgt;‑P<subgt;psbA2</subgt;‑cI857‑T<subgt;rbcl</subgt;转入聚球藻PCC 7942中，得到工程菌株MJJ‑01；将质粒pJA‑P<subgt;cpc560</subgt;‑slr0664‑T<subgt;rrnB</subgt;转入工程菌株MJJ‑01中，得到生物防逃逸系统，实验证明，在低于33℃温度条件下，防逃逸菌株可启动“杀死开关”而快速死亡，并可应用于生产3‑HP的代谢工程蓝细菌菌株中。

技术研发人员：宋馨宇,张卫文,陈磊,马佳佳,李智祥
受保护的技术使用者：天津大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16