一种非洲猪瘟病毒实时荧光PCR快速检测试剂盒的制作方法

：本发明属于生物，涉及一种非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒。

背景技术

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背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever，asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)引起家猪和某些野猪种的一种急性、高度接触性传染病。asf临床以高热和血细胞减少为特征，常伴有红斑、虚弱、呼吸心跳加快、呕吐、血便、鼻腔和结膜分泌物增多，在流行时，病死率可高达100％。该病属于世界动物卫生组织(oie)的法定报告动物疫病，对养猪业危害甚大，因此积极做好asf的防控工作极为重要。由于非洲猪瘟病毒有独特的免疫逃避机制，感染后，猪群虽可产生特异性的抗体，但这些抗体没有中和作用，也没有保护性，少数耐过猪虽可抵抗同源毒株的攻击，但是对异源毒株敏感，因此目前尚无有效的疫苗，控制非洲猪瘟主要手段是扑杀非洲猪瘟病原学检测为阳性的生猪及疫点、疫区内的所有生猪，并进行无害化处理，在这一过程中，非洲猪瘟病毒检测技术起着至关重要的作用。

2、非洲猪瘟病毒是一种核质巨dna病毒，在病毒分类中隶属于dna病毒目、非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属，为该科唯一成员，且是目前唯一已知的虫媒dna病毒。asfv病毒粒子具有双层囊膜结构，基因组为线性双链dna分子，不同毒株之间基因组大小存在一定差异，总体介于170～190kb之间；asfv基因组可编码150多个开放阅读框，成熟病毒粒子中含有50种以上结构蛋白。p72蛋白作为非洲猪瘟病毒的核衣壳蛋白，是asfv的主要结构蛋白，产生于病毒感染晚期，位于细胞内病毒粒子的中层或表层。p72与不同毒株asfv的单抗结合试验结果表明，p72是一种非常保守的抗原性蛋白，对自然感染具有免疫原性。因此，常被用作血清学诊断和免疫学检测抗原。

3、实时荧光pcr(real-time quantitative pcr，real-time qpcr)是融汇了pcr技术和光谱技术的一种核酸定量检测技术，具有敏感性高、特异性强、重复性好、全封闭反应、定量准确等优点，与常规pcr检测方法相比，解决了pcr假阳性和溴化乙锭对环境的污染问题，且可以实现定量检测。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、虽然目前市场上存在多种非洲猪瘟病毒的检测试剂盒，然而，产品的质量良莠不齐，检测的灵敏度不够高，往往在10-100拷贝/μl，不能满足生产需求。因而，开发高灵敏度、特异性的检测试剂盒对于丰富非洲猪瘟病毒的检测手段以及控制非洲猪瘟疫情的传播具有重要的意义。

2、为解决以上技术问题，本发明采用如下技术方案：

3、一组用于非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测的引物和探针，其特征在于，其包括asfv-f、asfv-r和asfv-p，其中asfv-f序列如seq id no：2所示，asfv-r序列如seq id no：3所示，asfv-p序列如seq id no：4所示。

4、优选地，在探针asfv-p的5’和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。

5、优选地，所述报告基团为fam，所述淬灭基团为tamra标记。

6、本发明还请求保护一种非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针，在探针的5’和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。

7、优选地，所述报告基团为fam，所述淬灭基团为tamra标记。

8、所述试剂盒还包括荧光pcr反应液a，荧光pcr反应液b，阳性对照和阴性对照，其中荧光pcr反应液b的制备是在无菌条件下，分别用去离子水将引物asfv-f、asfv-r和探针asfv-p溶解成终浓度为10μmol/l，将引物/探针asfv-f∶asfv-r∶asfv-p按1∶1∶1的比例配制成为引物/探针混合液。

9、所述荧光pcr反应液a的制备是将商品化的2×fastfire qpcr premix和rnase-free ddh2o，在无菌条件下，将2×fastfire qpcr premix∶rnase-free ddh2o按25∶17的比例配制成荧光pcr反应液a混合液，充分混匀，定量分装，-20℃保存备用。

10、所述阳性对照是含有核苷酸序列如seq id no：1所示序列的阳性质粒，所述阴性对照是去离子水。

11、本发明还请求保护一种非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测方法，其特征在于，采用本发明所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒进行检测，优选地，所述方法为诊断目的或非诊断目的的。

12、所述非诊断目的的检测包括对于猪饲料、养殖环境的检测以及生鲜猪肉或猪肉制品的检测。

13、基于以上技术方案，本发明取得了如下技术效果：

14、本发明以非洲猪瘟病毒p72基因作为目标检测基因，通过设计和筛选获得了特异性好、灵敏度高的引物组，该引物组检测的灵敏度可以达到2拷贝/μl，高于现有的检测方法，能够实现更早期的非洲猪瘟病毒感染的检测，基于该引物组构建的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒具有敏感性高、特异性强、重复性好、操作简便的优点，与oie推荐的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr检测方法以及中国动物卫生与流行病学中心提供的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr检测试剂的检测结果(符合率)达100％，可用于对临床样品中非洲猪瘟病毒的快速检测。

技术特征：

1.一组用于非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测的引物和探针，其特征在于，其包括asfv-f、asfv-r和asfv-p，其中asfv-f序列如seq id no：2所示，asfv-r序列如seq id no：3所示，asfv-p序列如seq id no：4所示。

2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，在探针asfv-p的5’和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。

3.根据权利要求2所述的引物组，其特征在于，所述报告基团为fam，所述淬灭基团为tamra标记。

4.一种非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，该试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针，在探针的5’和3’端分别标记报告基团和淬灭基团。

5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述报告基团为fam，所述淬灭基团为tamra标记。

6.根据权利要求5所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括荧光pcr反应液a，荧光pcr反应液b，阳性对照和阴性对照，其中荧光pcr反应液b的制备是在无菌条件下，分别用去离子水将引物asfv-f、asfv-r和探针asfv-p溶解成终浓度为10μmol/l，将引物/探针asfv-f∶asfv-r∶asfv-p按1∶1∶1的比例配制成为引物/探针混合液。

7. 根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述荧光pcr反应液a的制备是将商品化的2×fastfire qpcr premix和rnase-free ddh2o，在无菌条件下，将2×fastfire qpcr premix∶rnase-free ddh2o按25∶17的比例配制成荧光pcr反应液a混合液，充分混匀，定量分装，-20℃保存备用。

8. 根据权利要求6所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒，其特征在于，所述阳性对照是含有核苷酸序列如seq id no：1所示序列的阳性质粒，所述阴性对照是去离子水。

9.一种非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测方法，其特征在于，采用权利要求6-8中任一项所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测试剂盒进行检测，优选地，所述方法为诊断目的或非诊断目的的。

10.根据权利要求9所述的非洲猪瘟病毒实时荧光pcr快速检测方法，其特征在于，所述非诊断目的的检测包括对于猪饲料、养殖环境的检测以及生鲜猪肉或猪肉制品的检测。

技术总结
本发明以非洲猪瘟病毒p72基因作为目标检测基因，通过设计和筛选获得了特异性好、灵敏度高的引物组，该引物组检测的灵敏度可以达到2拷贝/μl，高于现有的检测方法，能够实现更早期的非洲猪瘟病毒感染的检测，基于该引物组构建的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR快速检测试剂盒具有敏感性高、特异性强、重复性好、操作简便的优点，与OIE推荐的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测方法以及中国动物卫生与流行病学中心提供的非洲猪瘟病毒实时荧光PCR检测试剂的检测结果（符合率）达100%，可用于对临床样品中非洲猪瘟病毒的快速检测。

技术研发人员：张磊,陈瑞,王昆,董剑辉
受保护的技术使用者：武汉华腾济康生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13