一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒与流程

本发明涉及检测hbv基因，尤其涉及检测hbv前c区基因突变技术。

背景技术：

1、乙型肝炎病毒英文简称hbv，有文献报道其与肝细胞肝癌、肝硬化有显著相关。hbv基因组复制时会先转录为rna中间体，而聚合酶不能校正，导致了高突变。高变异率对hbv有效治疗来说是个不小的挑战，基因组多态性会影响乙肝诊断、治疗、预后。hbv前c区(precore，pc)及核心启动子(cp)区的常见变异，可导致hbeag阴性而病毒持续复制，仅凭血清hbeag水平并不能判断病毒复制情况，因此容易错过早期干预治疗的时机；变异也会使hbv发生耐药，是影响药物持续疗效的一个重要因素。一些临床上使用的抗hbv药物在患者身上经过一段用药时间后会出现用药无效的情况，因而症状发生恶化；也加大慢性肝炎、肝硬化、癌变倾向的概率。

2、因此，检测hbv前c区(precore，pc)及核心启动子(cp)区的常见变异对评估乙肝患者预后有一定价值，可用于联合评估肝病进展风险，拟定治疗方案及严格的随访策略，对防止或早期发现肝癌有一定临床价值，但是准确检测hbv前c区(precore，pc)及核心启动子(cp)区的常见变异还是存在困难。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒，以解决现有技术中不能完整、灵敏准确检测出hbv前c区(precore，pc)及核心启动子(cp)区的常见变异的问题。

2、为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

3、一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组，包括pcr扩增引物，核苷酸序列如seq id no.1～2所示。

4、更优地，还包括测序pcr引物，核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、本发明还提供一种所述的引物组在制备用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。

6、本发明还提供一种包含所述引物组的用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的试剂盒，包含：

7、pcr反应液，其包括含mg2+的10×pcr buffer 5μl，10mm dntps 1μl，10μm seq idno.1所示扩增引物2μl，10μm seq id no.2所示扩增引物2μl，h2o 17μl；

8、pcr酶系，其包括热启动taq酶2.5u；

9、bigdye；

10、bigdye buffer；

11、核苷酸序列如seq id no.3所示。

12、本发明还提供一种应用所述的引物组检测hbv前c区及核心启动子区突变的方法，步骤包括：提取hbv核酸作为模板，以seq id no.1～2所示的引物作为pcr扩增引物进行pcr扩增反应，以seq id no.3所示的引物作为测序pcr引物进行测序pcr反应，对测序pcr产物进行测序分析，得到突变信息。

13、一种包含所述的引物组的扩增体系，包括：

14、pcr酶系3μl，其包括热启动taq酶2.5u，剩余用甘油和水补齐；

15、pcr反应液27μl，其包括含mg2+的10×pcrbuffer 5μl，10mm dntps 1μl，10μm seqid no.1所示扩增引物2μl，10μm seq id no.2所示扩增引物2μl，h2o 17μl；

16、hbv样本核酸20μl。

17、一种应用所述的扩增体系的扩增方法，扩增程序为：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。

18、一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，

19、pcr扩增体系包括：

20、pcr酶系3μl，其包括热启动taq酶2.5u，剩余用甘油和水补齐；

21、pcr反应液27μl，其包括含mg2+的10×pcrbuffer 5μl，10mm dntps 1μl，10μm seqid no.1所示扩增引物2μl，10μm seq id no.2所示扩增引物2μl，h2o 17μl；

22、hbv样本核酸20μl；

23、测序pcr体系包括：

24、pcr产物xμl，x取值视浓度高低而定，可以根据琼脂糖凝胶电泳所得条带亮度来判读浓度高低，浓度高，则条带亮，x取值1-2，若产物浓度低，则条带亮度偏暗，x取值4-5；

25、bigdye 2μl；

26、bigdye buffer 3μl；

27、测序引物1μl；

28、无菌水14-xμl；

29、测序引物如seq id no.3所示。

30、一种应用所述的扩增测序体系检测hbv前c区及核心启动子区突变的方法，过程如下：

31、(1)提取hbv核酸作为模板；

32、(2)配制pcr扩增体系，按如下程序进行扩增：95℃5分钟预变性；然后按“94℃30秒，57℃30秒，72℃30秒”40个循环扩增；最后72℃延伸5分钟，4℃保温；

33、(3)配制测序pcr体系，按如下程序进行测序pcr反应：96℃预变性1分钟；96℃变性10秒，50℃退火5秒，60℃延伸4分钟，25个循环；4℃保温；

34、测序pcr产物纯化及sanger测序分析，得到相关的突变类型信息。

35、本发明的优点包括：针对hbv前c区及核心启动子区，设计特异性引物，采用pcr体外扩增法结合sanger测序技术，检测hbv病毒前c区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前c区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μl。

技术特征：

1.一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的一种用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的引物组，其特征在于：

3.一种如权利要求1或2所述的引物组在制备用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种包含如权利要求2所述引物组的用于检测hbv前c区及核心启动子区突变的试剂盒，其特征在于：

5.一种应用如权利要求2所述的引物组检测hbv前c区及核心启动子区突变的方法，其特征在于：

6.一种包含如权利要求1所述的引物组的扩增体系，其特征在于：

7.一种应用如权利要求6所述的扩增体系的扩增方法，其特征在于：

8.一种包含如权利要求2所述的引物组的扩增测序体系，其特征在于：

9.一种应用如权利要求8所述的扩增测序体系检测hbv前c区及核心启动子区突变的方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种用于检测HBV前C区及核心启动子区突变的引物组、检测方法及其试剂盒。引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，使用引物组配制PCR扩增体系和测序体系，经过PCR扩增反应和测序反应，再进行测序，获得HBV前C区及核心启动子区突变信息。本发明优点包括：针对HBV前C区及核心启动子区，设计特异性引物，采用PCR体外扩增法结合Sanger测序技术，检测HBV病毒前C区和核心启动子区基因突变，扩增总长度约为344bp，能有效覆盖前C区及核心启动子区的突变位点，灵敏度能够达到200copies/μL。

技术研发人员：李葆华,甘小洪,刘菲,余治学,陈曦
受保护的技术使用者：赛立安生物技术（广州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13