一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法与流程

本发明涉及生物化工，尤其涉及一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法。

背景技术：

1、类固醇具有重要的生理功能和广泛的临床应用，目前它们是仅次于抗生素的第二大类药物。在类固醇药物中，许多药物在1,2位上含有双键，它们通常具有更强的效力，并能减少药物引起的盐分滞留。例如，泼尼松龙的抗炎能力是氢化可地松的四倍，是可的松的五倍。因此，对类固醇化合物进行δ1-脱氢是类固醇研究中的一个重要方向。这种转化可以通过化学或生物催化的方法实现。由于类固醇分子的复杂性，化学方法需要一系列复杂的反应步骤。例如通过tbdmscl将ddq(二氯二氰基苯醌)与δ4-3酮类固醇进行δ1-脱氢反应，整个反应需要7步。这些化学方法的生产工艺比较复杂，能耗高，对环境的污染严重。而生物催化类固醇的δ1-脱氢通常在温和的条件下进行，具有很高的区域选择性，因此生产步骤简单，产生的污染物较少，对环境更加友好，满足可持续性发展的要求。

2、目前也有一些文献报道过3-酮基甾体-δ1-脱氢酶的融合表达与纯化，但是他们构建出的质粒pet-ksdd在大肠杆菌中经过iptg诱导后产生的酶为不具备生物学功能的包涵体，要获得具有一定生物学功能的酶，还需要进行变性与复性以后才能够正常的使用，且复性后的酶对底物的转化率较低，只能达到15.6％。

3、公开号为cn101397324a、cn1361108a、cn105384790a的专利均公开了多步化学合成制备泼尼松龙的方法，但上述专利普遍路线较多、工艺繁杂以及生产周期较长，收率普遍较差，这些也增加了泼尼松龙的生产成本。

4、关于生物催化类固醇的方法中，公开号为cn107058444a的专利公开了一种生物酶法制备泼尼松龙的方法，克服了工艺复杂、耗时长和转化率低等技术问题，该方法虽说也是一步法制备泼尼松龙，但是在制备过程中除了酶以外还需要其他几种试剂来参与反应，大大增加了生产的成本。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提出了一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，解决了现有技术中转化率低、收率不理想以及合成步骤复杂等技术问题。

2、本发明的技术方案是这样实现的：

3、本发明提供了一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，包括如下步骤：

4、s1，构建含有kstd基因的重组质粒pet-21a(+)-kstd；

5、s2，取含有步骤s1所述重组质粒pet-21a(+)-kstd的细胞，转接于培养基，加入iptg培养，诱导目的蛋白表达，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化；

6、s3，将氢化可的松乳化处理，溶于缓冲溶液，加入pms和步骤s2纯化得到的pet-21a(+)-kstd催化酶，于25-30℃反应12-16h，即得到泼尼松龙。

7、

8、通过pcr扩增出kstd酶的相关基因，其引物的序列为：f:5‘aatgggtcgcggatccgtagatcagatgaataatattaccgttatggatc 3’，r:5‘gacggagctcgaatttgtatgacctgcggttgcatg3’。

9、通过pcr扩增使载体pet-21a(+)线性化，使用的引物为：f:5‘aattcgagctccgtcgacaag3’，r:5‘gatccgcgacccatttgct 3’。

10、进一步优选地，s1具体包括如下步骤：

11、s1，pcr扩增kstd基因，根据引物序列使载体pet-21a(+)线性化，将kstd基因与线性化后的pcr产物混合，加入dna连接酶，于45-50℃反应10-15min，通过无缝克隆连接，构建得到重组质粒pet-21a(+)-kstd。

12、进一步优选地，s2具体包括如下步骤：

13、s2，取含有步骤s1所述重组质粒pet-21a(+)-kstd的细胞，转接于含amp抗性的lb培养基，于35-37℃培养菌液，加入iptg后于20-25℃培养15-18h，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化。

14、进一步优选地，所述pet-21a(+)-kstd催化酶具有如seq id no.1所示的序列结构，所述seq id no.1为核苷酸序列，序列结构见序列表。

15、进一步优选地，所述pet-21a(+)-kstd催化酶具有如seq id no.2所示的序列结构，所述seq id no.2为氨基酸序列，序列结构见序列表。

16、进一步优选地，步骤s2、s3所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，ph值为7-9，浓度为0.05-0.1mol/l。

17、进一步优选地，步骤s1中kstd基因、pcr产物和dna连接酶的体积比为(0.5-0.6)：1：(9-10)。

18、进一步优选地，步骤s2培养菌液至od600值为0.6-0.8。

19、进一步优选地，步骤s2中iptg浓度为1.8-2mm/l。

20、进一步优选地，步骤s3中氢化可的松、pet-21a(+)-kstd催化酶和pms的质量比为1：(0.001-0.002)：(0.01-0.02)。

21、本发明的氢化可的松转化泼尼松龙的方法，相对于现有技术，具有以下有益效果：

22、(1)本发明通过正确构建重组质粒pet-21a(+)-kstd，提高kstd催化酶的活性，再利用大肠杆菌bl21作为工业菌株，能将氢化可的松高效的转化成泼尼松龙，10吨的酶转体系下转化率可达97％，收率高；

23、(2)本发明合成方法所需试剂少，工艺简单，设备要求低，不产生污染物，符合绿色环保的理念；

24、(3)相比现有化学合成泼尼松龙方法，在泼尼松龙产量一致的情况下，生物合成的成本要比化学合成低10倍。

技术特征：

1.一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，s1具体包括如下步骤：

3.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，s2具体包括如下步骤：

4.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，所述pet-21a(+)-kstd催化酶具有如seq id no.1所示的序列结构。

5.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，所述pet-21a(+)-kstd催化酶具有如seq id no.2所示的序列结构。

6.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，步骤s2、s3所述缓冲溶液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液，ph值为7-9，浓度为0.05-0.1mol/l。

7.如权利要求2所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，步骤s1中kstd基因、pcr产物和dna连接酶的体积比为(0.5-0.6)：1：(9-10)。

8.如权利要求3所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，步骤s2培养菌液至od600值为0.6-0.8。

9.如权利要求3所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，步骤s2中iptg浓度为1.8-2mm/l。

10.如权利要求1所述的一种氢化可的松转化泼尼松龙的方法，其特征在于，步骤s3中氢化可的松、pet-21a(+)-kstd催化酶和pms的质量比为1：(0.001-0.002)：(0.01-0.02)。

技术总结
本发明提出了一种氢化可的松转化泼尼松龙的合成方法，包括以下步骤：S1，构建重组质粒pET‑21a(+)‑KstD；S2，取含有所述重组质粒pET‑21a(+)‑KstD的细胞，转接于培养基培养，诱导目的蛋白表达，再加入缓冲溶液重悬菌体，超声破碎细胞，离心、纯化；S3，将氢化可的松乳化处理，溶于缓冲溶液，加入PMS和pET‑21a(+)‑KstD催化酶，于25‑30℃反应12‑16h，即得到泼尼松龙；相比现有合成泼尼松龙的方法，本发明的方法收率高、所需试剂少、工艺简单、设备要求低、符合绿色环保的理念。

技术研发人员：夏海,系祖斌,李明磊,陶琳,姚立成
受保护的技术使用者：湖北共同甾体药物研究院有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15