一种抗泌乳素受体的纳米抗体、重组载体、重组菌和应用的制作方法

本发明属于纳米抗体，具体涉及一种抗泌乳素受体的纳米抗体、重组载体、重组菌和应用。

背景技术：

1、泌乳素是一种多肽激素，于1477年从牛脑垂体提取得到，因其能促进兔子泌乳而得名。在人类基因组中，编码泌乳素的基因位于6号染色体。泌乳素基因全长10kb，由5个外显子和4个内含子组成。泌乳素由垂体腺垂体区，和许多垂体外部位分泌，主要包括淋巴细胞、泌乳乳腺的上皮细胞、上皮来源的乳腺癌细胞和胎盘。泌乳素发挥作用的方式有三种：自分泌、旁分泌和内分泌。

2、泌乳素受体广泛存在于周围器官中，如垂体、心脏、肺、大脑、胸腺、脾脏、肝脏、胰腺、肾脏、肾上腺、子宫、骨骼肌和皮肤。泌乳素受体主要可分为细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内激活信号结构域。泌乳素可与泌乳素受体细胞外结构域结合，激活下游信号转导通路，调节一些生理和生化过程，比如在乳腺发育、泌乳、血管生成、子痫前期、肿瘤、产妇糖尿病和抗凋亡等方面的作用。

3、泌乳素受体的下游信号通路主要有jak1/stat3，jak2/stat5，pi3k/akt，和raf/mek/erk信号通路。stat蛋白包含一个dna结合域、一个类sh3域、一个类sh2域、一个nh2-和一个cooh端激活域。磷酸化的泌乳素受体与stat的sh2结构域相互作用。当stat与泌乳素受体相互作用时，被受体相关的jak激酶磷酸化。磷酸化的stat分子与受体分离，通过其磷酸化的酪氨酸残基与另一个磷酸化stat分子的sh2结构域结合，形成异或同二聚。最后，stat二聚体转移到细胞核，激活靶基因启动子中的stat dna结合基序。

4、已有的研究表明，泌乳素以及泌乳素受体异常与各种癌症相关，且体外和体内实验均能证实抑制泌乳素下游信号通路可以治疗癌细胞的生长。但是现有的专利和技术无法将其转化为治疗应用。因此，亟需一种高亲和力，更稳定，不受限给药方式的抗体治疗泌乳素以及泌乳素受体异常所致疾病。

5、纳米抗体(nanobody，nb)是1989年，从羊驼外周血液中发现的一种天然缺失轻链的抗体。纳米抗体由于轻链缺失，只包含一个重链可变区(vhh)和两个常规的ch2与ch3区，也被称为重链单域抗体，分子量(约15kda)，是传统抗体的十分之一左右，其蛋白质晶体结构长度为4nm，直径为2.5nm。是现阶段发现的自然存在的可与抗原结合的最小片段。纳米抗体因其体积和分子量小，具有良好的组织穿透性，可以穿透血脑屏障达到传统抗体到达补料的病灶组织，且以排出，半衰期短，极大避免了毒性作用。因此，纳米抗体应用于抑制泌乳素与泌乳素受体的结合中能有效避免下游信号转导通路的激活，从而治疗因泌乳素/泌乳素受体异常所致疾病。然而目前缺乏与泌乳素受体高亲和性的纳米抗体。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗泌乳素受体的纳米抗体，具有与泌乳素受体高亲和性结合的特点。

2、本发明目的还在于提供一种表达所述纳米抗体的重组载体和重组菌，为治疗泌乳素受体异常所致疾病提供丰富的材料。

3、本发明提供了一种抗泌乳素受体的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seqid no:1所示。

4、本发明提供了一种抗泌乳素受体的纳米抗体融合蛋白，所述纳米抗体融合蛋白为信号肽-连接肽-所述纳米抗体-fc区域，氨基酸序列如seq id no:2所示。

5、本发明提供了一种所述纳米抗体融合蛋白的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

6、本发明提供了一种包含所述编码基因的重组表达载体。

7、优选的，所述重组表达载体的骨架载体为pcdna3.1。

8、优选的，所述编码基因插入所述骨架载体的多克隆位点为not1/xba1。

9、本发明提供了一种包含所述重组表达载体的工程菌。

10、优选的，所述工程菌的宿主菌包括原核表达系统和/或真核表达系统。

11、本发明提供了所述纳米抗体、所述纳米抗体融合蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述工程菌在制备抑制泌乳素与泌乳素受体结合的药物中的应用。

12、本发明提供了所述纳米抗体、所述纳米抗体融合蛋白、所述编码基因、所述重组表达载体或所述工程菌在制备预防和/或治疗泌乳素或泌乳素受体异常导致的疾病的药物中的应用；

13、优选的，所述疾病包括以下至少一种：不孕症、溢乳症、催乳素瘤、闭经、月经不调、视觉障碍、垂体功能减退、系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、白塞病、干燥综合症、银屑病、高泌乳素血症、痤疮和乳腺癌。

14、本发明提供了一种抗泌乳素受体的纳米抗体，所述纳米抗体的氨基酸序列如seqid no:1所示。本发明利用噬菌体展示文库筛选得到能够与泌乳素受体高亲和性结合的纳米抗体。实验表明本发明筛选出了30种纳米抗体cq01～cq30，经亲和力试验测定，本发明保护的纳米抗体cq24与人泌乳素受体-ecd蛋白结合时ec50为4.6ng/ml，而其他种类纳米抗体的ec50均大于4.6ng/ml，远远高于纳米抗体cq24。可见，本发明筛选得到的cq24纳米抗体高亲和性结合与泌乳素受体，可用于制备抑制泌乳素受体药物，为治疗泌乳素和泌乳素受体异常导致的疾病提供了新手段。

技术特征：

1.一种抗泌乳素受体的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如seq idno:1所示。

2.一种抗泌乳素受体的纳米抗体融合蛋白，其特征在于，所述纳米抗体融合蛋白为信号肽-连接肽-权利要求1所述纳米抗体-fc区域，氨基酸序列如seq id no:2所示。

3.一种权利要求2所述纳米抗体融合蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no:3所示。

4.一种包含权利要求3所述编码基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的骨架载体为pcdna3.1。

6.根据权利要求5所述重组表达载体，其特征在于，所述编码基因插入所述骨架载体的多克隆位点为not1/xba1。

7.一种包含权利要求4～6中任意一项所述重组表达载体的工程菌。

8.根据权利要求7所述工程菌，其特征在于，所述工程菌的宿主菌包括原核表达系统和/或真核表达系统。

9.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述纳米抗体融合蛋白、权利要求3所述编码基因、权利要求4～6中任意一项所述重组表达载体或权利要求7或8所述工程菌在制备抑制泌乳素与泌乳素受体结合的药物中的应用。

10.权利要求1所述纳米抗体、权利要求2所述纳米抗体融合蛋白、权利要求3所述编码基因、权利要求4～6中任意一项所述重组表达载体或权利要求7或8所述工程菌在制备预防和/或治疗泌乳素或泌乳素受体异常导致的疾病的药物中的应用；

技术总结
本发明提供了一种抗泌乳素受体的纳米抗体、重组载体、重组菌和应用，属于纳米抗体技术领域。本发明利用噬菌体展示文库筛选得到能够与泌乳素受体高亲和性结合的纳米抗体，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。实验表明本发明筛选出了30种纳米抗体CQ01～CQ30，经亲和力试验测定，本发明保护的纳米抗体CQ24与人泌乳素受体‑ECD蛋白具有最高的亲和性。本发明筛选得到的CQ24纳米抗体可用于制备抑制泌乳素受体药物，为治疗泌乳素和泌乳素受体异常导致的疾病提供了新手段。

技术研发人员：赵伟军,白可可,陈雪丹,姜玲
受保护的技术使用者：浙江触奇生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14