基于两拷贝基因筛选高表达眼镜王蛇联合肽DAMP4-OH30重组菌株的方法与流程

本发明涉及基因工程，尤其涉及基于两拷贝基因筛选高表达眼镜王蛇联合肽damp4-oh30重组菌株的方法。

背景技术：

1、利用基因工程的方法异源抗菌肽有两大困难，首先，抗菌肽对某些宿主细胞如毕赤酵母有毒，具极强的杀伤作用；其次，抗菌肽分子量很小，且大多数都是强阳离子抗菌肽，不稳定且容易被表达菌株自身表达的蛋白酶降解。为了解决抗菌肽表达所面临的困难，大规模生产抗菌肽经常与融合标签串联表达。抗菌肽表达常用的融合标签有 mbp、谷胱甘肽s 转移酶（gst）、弹性蛋白样多肽（elp）、sumo、硫氧还蛋白 a（trx a）等。这些融合标签不仅能帮助抗菌肽以可溶性的方式表达，提高抗菌肽的表达量，而且在后续的分离纯化过程中起到一定的作用。

2、damp4是一个能够耐高温高盐的融合蛋白标签，由四个α螺旋结构构成的小分子蛋白，能够通过非层析的方法实现重组蛋白的分离纯化，节省了繁琐的分离纯化步骤，从而降低了生产成本。眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30是由30个氨基酸组成的cathelicidins的截短肽，目前研究发现其对大肠杆菌（ escherichia coli）、铜绿假单胞菌（ pseudomona  aeruginosa ）、金黄色葡萄球菌（ staphylococcus aureus）和产气肠杆菌( enterobacter  aerogenes)等多种革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑菌效果。因此，眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30是一种非常有前景的药物候选分子，可以用来治疗各种常规抗生素耐药菌引起的感染。

3、目前，无论是通过化学合成或者生物合成，所获得的眼镜王蛇抗菌肽oh-cath30产量都无法满足实际使用中的需求。本发明采用眼镜王蛇抗菌肽基因与damp4蛋白标签构建联合肽，将其通过酶切酶连形成两拷贝基因，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取眼镜王蛇抗菌肽联合肽。

技术实现思路

1、本发明的目的是要提供基于两拷贝基因筛选高表达眼镜王蛇联合肽damp4-oh30重组菌株的方法，采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联眼镜王蛇联合肽damp4-oh30。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、（1）眼镜王蛇联合肽damp4-oh30两拷贝载体的构建

4、①根据之前已经构建好的damp4-oh30-ppiczαa重组质粒，分别利用两组限制性内切酶对重组质粒进行双酶切，获得目的片段；同时对ppiczαa质粒进行双酶切，回收酶切后的线性化ppiczαa质粒。

5、②利用t4连接酶，将双酶切后获得的目的片段进行连接，随后将连接产物与双酶切后回收的ppiczαa质粒进行连接，获得多拷贝数的重组表达载体，对连接产物进行鉴定。

6、（2）重组酵母菌株的诱导表达及检测

7、①重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌。

8、②对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的两拷贝眼镜王蛇抗菌肽联合肽蛋白。

9、优选的，所述的ppiczαa表达载体构建包括以下内容：ppiczαa载体的酶切及酶切产物回收；眼镜王蛇抗菌肽联合肽序列和载体的连接；连接产物的鉴定。

10、优选的，所述的连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

11、其中，所述的眼镜王蛇抗菌肽基因的核苷酸序列可以是任何一种基因的核苷酸序列。核苷酸序列是通过毕赤酵母密码子偏好性优化后的核苷酸序列。

12、本发明选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。

13、本发明对测序鉴定后的质粒酶切线性化后电转化x33毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于ypd平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，发酵液采用sds-page分离后，以获得表达眼镜王蛇联合肽的发酵液蛋白。发酵液蛋白经ni-nta琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所得到的眼镜王蛇联合肽纯化。

14、本发明的有益效果在于：

15、（1）本发明采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联蛋白，将眼镜王蛇联合肽表达产量提高多倍；本发明提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。

16、（2）本发明提供的构建方法获得的两拷贝表达相较于眼镜王蛇联合肽的单拷贝表达，使得眼镜王蛇联合肽的产量提高2倍以上，且并未增加生产工序，生产成本基本与单拷贝表达持平。

技术特征：

1.基于两拷贝基因筛选高表达眼镜王蛇联合肽damp4-oh3重组菌株的方法，其特征在于包括以下步骤：

技术总结
本发明公开了基于两拷贝基因筛选高表达眼镜王蛇联合肽DAMP4‑OH3重组菌株的方法。本发明通过毕赤酵母密码子偏好性优化设计核苷酸序列，构建眼镜王蛇联合肽DAMP4‑OH30两拷贝载体，获得两拷贝的重组表达载体，对重组酵母菌株的诱导表达，制备眼眼镜王蛇联合肽。本发明采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联蛋白，将眼镜王蛇联合肽表达产量提高多倍；本发明提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。

技术研发人员：刘杰,贾晓颖,吴杭,沈李元,朱新鹏
受保护的技术使用者：江苏亢钧生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14