多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM-CATH的方法与流程

本发明涉及基因工程，尤其涉及多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽am-cath的方法。

背景技术：

1、短吻鳄抗菌肽am-cath是从美国短吻鳄（ alligator mississippiensis）发现了的一种抗菌肽，其由一个n端的α-螺旋和一个中心脯氨酸铰链组成。抗菌肽am-cath以及其两个截短肽对多种革兰氏阴性菌，包括临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌（ acinetobacter  baumannii）和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（ klebsiella pneumoniae）有较强的抑菌活性。使用溴化乙二胺吸收试验，发现这些肽可透过细菌细胞膜，对盐抑制的敏感性低于许多其他已知的肽链。在3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化铵（mtt）作用24小时后，短吻鳄抗菌肽am-cath对绵羊红细胞无溶血作用，对a549人肺上皮细胞无明显细胞毒性。与人类的ll-37相似，短吻鳄抗菌肽cathelicidins可能在短吻鳄的先天免疫反应中发挥重要作用。

2、目前，无论是通过化学合成或者生物合成方法合成短吻鳄抗菌肽am-cath，所获得的短吻鳄抗菌肽am-cath产量都无法满足实际工业使用中的需求。本发明采用短吻鳄抗菌肽基因，将其通过酶切酶连形成多拷贝基因，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取短吻鳄抗菌肽。

技术实现思路

1、本发明通过采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，通过发酵工艺优化，实现短吻鳄抗菌肽am-cath的高水平合成。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、1）将短吻鳄抗菌肽am-cath全基因合成并插入到ppiczαa载体上，成功构建单拷贝am-cath-ppiczαa重组质粒，分别利用两组限制性内切酶对单拷贝重组质粒进行双酶切，获得两段包含有抗菌肽am-cath的基因片段；同时对ppiczαa质粒进行双酶切，回收酶切后的线性化质粒；

4、2）利用t4连接酶，将双酶切后获得的目的片段进行连接，随后将连接产物与双酶切后回收的ppiczαa质粒进行连接，获得两拷贝数的重组表达载体，对连接产物进行鉴定；

5、3）将含测序正确的重组质粒的菌株划线培养，挑取单克隆添加到lb培养基中，37℃ 180rpm摇培12h，然后利用试剂盒提取重组质粒。

6、1）将重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；

7、2）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的两拷贝短吻鳄抗菌肽am-cath蛋白。

8、优选的，所述的ppiczαa表达载体构建包括以下内容：ppiczαa载体的酶切及酶切产物回收；短吻鳄抗菌肽am-cath序列和载体的连接；连接产物的鉴定。

9、优选的，所述的连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。

10、其中，所述的短吻鳄抗菌肽am-cath基因的核苷酸序列可以是任何一种基因的核苷酸序列；核苷酸序列是通过毕赤酵母密码子偏好性优化后的核苷酸序列。

11、本发明选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。

12、本发明对提取的重组质粒酶切线性化后电转化x33毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于ypd平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，发酵液采用sds-page分离后，以获得表达短吻鳄抗菌肽am-cath的发酵液蛋白。发酵液蛋白经ni-nta琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所得到的短吻鳄抗菌肽am-cath纯化。

13、本发明的有益效果在于：

14、（1）本发明采用酵母表达短吻鳄抗菌肽am-cath时，通过串联两拷贝的方式，将短吻鳄抗菌肽am-cath表达产量提高2-3倍。

15、（2）本发明采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联蛋白；本发明提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。

16、（3）本发明相较于短吻鳄抗菌肽am-cath的单拷贝表达，使得短吻鳄抗菌肽am-cath的产量提高2-3倍，且并未增加生产工序，生产成本与单拷贝表达的成本基本持平。

技术特征：

1.多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽am-cath的方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽am-cath的方法的步骤a中（3），提取重组质粒后对测序鉴定后的重组质粒酶切线性化后电转化x33毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于ypd平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，发酵液采用sds-page分离后，以获得表达短吻鳄抗菌肽am-cath的发酵液蛋白；发酵液蛋白经ni-nta琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所得到的短吻鳄抗菌肽am-cath纯化。

3.根据权利要求1所述的多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽am-cath的方法的步骤b中（1）中诱导表达的bmmy培养基的配制：酵母提取物yeast extract 2.6%，蛋白胨peptone 2%, 磷酸钾缓冲液(ph=6.0)100mmol/l, ynb 1.2%, 硫酸铵 1%，加水配置成100ml的培养基。

技术总结
本发明公开了多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM‑CATH的方法，属于基因工程与生物工程技术领域。本发明构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联蛋白，将短吻鳄抗菌肽AM‑CATH表达产量提高2‑3倍。然后通过构建和优化两拷贝整合方法，并通过发酵工艺优化，实现短吻鳄抗菌肽AM‑CATH的高水平合成，本发明提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。

技术研发人员：刘杰,丁冬,张婷婷,朱春生,储欣悦
受保护的技术使用者：江苏亢钧生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14