一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法及其在固定酸性地下水中砷方面的应用

本发明涉及治理地下水污染，尤其涉及一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法及其在固定酸性地下水中砷方面的应用。

背景技术：

1、我国南方典型有色金属矿区中铁含量丰富，利用矿区中广泛存在的铁氧化物实现砷的自然衰减是一种有效且环境友好的方法，但是这要求适宜的氧气和ph介导铁的化学氧化。例如稻田土壤中淹水排水条件的变化会介导fes的氧化，这一过程伴随着次生矿物的生成和污染物的迁移转化。但当化学条件不适宜时，需要相关功能微生物参与到铁的氧化。例如嗜酸性微生物能够耐受极酸性的ph条件，氧化fe(ⅱ)生成施氏矿物、黄钾铁矾等在酸性条件下稳定存在的矿物。此外，在海洋沉积物中也发现一种微需氧的铁氧化微生物，它们能够适应较低的氧气含量，在深海中介导“铁垫”的形成。这些功能的铁氧化微生物的存活往往不受有机碳条件的限制，能够利用环境中的无机碳生存，通过将fe(ⅱ)氧化而获取能量，并且通过介导铁的氧化和次生成矿等过程同步实现重(类)金属在环境中的吸附和共沉淀。例如，嗜酸性微生物能够介导amd中铁氧化物的形成进而实现污染物的自然衰减。最新研究在稻田土壤中发现的微需氧微生物也能够同步将铁的氧化、碳的固定耦合。

2、在矿区地下水中往往含有较低的氧气浓度和较低的ph。氧气和ph是环境中限制铁化学氧化速率的两大关键限制因素。先前分别有在氧气和ph限制条件下实现铁氧化进而固定砷的方法，例如cn108114975a公布了一种微好氧菌团治理砷污染土壤的方法。cn111620444a公布了嗜酸性铁氧化菌氧化铁诱导铁的生物成矿并除砷的方法。但是，在氧气和ph同时限制的酸性矿区地下水环境中，功能微生物介导的铁的氧化并同时固定砷的方法少有报道。

技术实现思路

1、为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法及其在固定酸性地下水中砷方面的应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

3、本发明提供了一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，包括如下步骤：

4、(1)在mwmm培养基中加入维生素混合液和微量元素混合液，调节培养基ph为4.5，得混合培养基；

5、(2)将fes固体培养基与所述混合培养基顺次加入培养管中形成反向铁氧浓度梯度，得富集培养基；

6、(3)将砷污染土壤与无菌水混合，得接种液；

7、(4)将所述接种液接种于所述富集培养基中进行富集培养，每24～26d传代一次，经过三次传代后得嗜酸性微需氧铁氧化菌。

8、优选的，步骤(1)中所述mwmm培养基以超纯水为溶剂，包括如下浓度的组分：k2hpo40.04～0.06g/l，mgso4·7h2o 0.1～0.3g/l，nh4cl 0.5～1.5g/l，cacl2·2h2o 0.05～0.15g/l，琼脂1～2g/l。

9、优选的，步骤(1)中所述mwmm培养基中还包括质量浓度为24～26ppm的砷。

10、优选的，步骤(1)中所述维生素混合液与mwmm培养基的体积比为1:900～1100，所述微量元素混合液与mwmm培养基的体积比为1:900～1100。

11、优选的，步骤(1)中所述维生素混合液以超纯水为溶剂，包括如下浓度的组分：氨三乙酸1～2g/l，mgso4·h2o 2～4g/l，mnso4·h2o 0.4～0.6g/l，nacl 0.5～1.5g/l，feso4·7h2o 0.05～0.15g/l，cocl2·6h2o 0.05～0.15g/l，cacl20.05～0.15g/l，znso4·7h2o 0.05～0.15g/l，cuso4·5h2o 0.05～0.15g/l，alk(so4)2·12h2o 0.005～0.015g/l，h3bo30.005～0.015g/l，na2moo4·2h2o0.005～0.015g/l；

12、所述微量元素混合液以超纯水为溶剂，包括如下浓度的组分：生物素1～3mg/l，叶酸1～3mg/l，盐酸吡哆辛8～12mg/l，盐酸硫胺素4～6mg/l，核黄素4～6mg/l，烟酸4～6mg/l，泛酸钙4～6mg/l，维生素b120.05～0.15mg/l，对氨基苯甲酸4～6mg/l，硫辛酸4～6mg/l。

13、优选的，步骤(1)中所述调节培养基ph的组分为硫酸溶液，所述硫酸溶液的浓度为18～22vt％。

14、优选的，步骤(2)中所述fes固体培养基与所述混合培养基的混合体积比为3～5:18～22，所述fes固体培养基由琼脂和fes溶液组成，所述fes溶液的浓度为0.5～1.5g/50ml，所述fes固体培养基中琼脂与fes溶液的比例为1～2g:100ml。

15、优选的，步骤(3)中所述砷污染土壤的含砷量为0.46～1.65g/kg，所述砷污染土壤的含铁量为114～158g/kg，所述砷污染土壤与无菌水的混合比例为1～2g:1～2ml；

16、步骤(4)中所述接种液与富集培养基的体积比为90～110μl:20～25ml，所述富集培养为恒温避光培养，所述富集培养的温度为20～30℃。

17、本发明还提供了上述富集培养方法富集得到的嗜酸性微需氧铁氧化菌。

18、本发明还提供了上述嗜酸性微需氧铁氧化菌在固定酸性地下水中砷方面的应用。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

20、1、本发明能够在氧气和ph同时限制的极端环境中利用嗜酸性微需氧铁氧化菌的活性，介导二价铁的生物氧化。嗜酸性微需氧铁氧化菌适应性强，铁氧化效率高，砷固定效果好，是一种无污染的，安全的治理手段。

21、2、本发明通过将富集培养得到的嗜酸性微需氧铁氧化菌菌液接种在深层水中，模拟地下水环境，通过微生物的作用，突破氧气和ph条件的限制，使其对铁(fe)和砷(as)生物氧化进而实现砷的固定。本发明方法可以有效降低砷的迁移性和生物可利用性。本发明菌液筛选自矿区环境，适应性强，化能自养，无需投加有机质，无二次污染，是一种基于自然的解决方案。本发明适用于地下水等微需氧环境中砷的固定，利用铁氧化菌的活性可加速铁的生物矿化及其对砷的固定，为地下水污染的治理提供了参考依据。

技术特征：

1.一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述mwmm培养基以超纯水为溶剂，包括如下浓度的组分：k2hpo40.04～0.06g/l，mgso4·7h2o0.1～0.3g/l，nh4cl0.5～1.5g/l，cacl2·2h2o0.05～0.15g/l，琼脂1～2g/l。

3.根据权利要求1或2所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述mwmm培养基中还包括质量浓度为24～26ppm的砷。

4.根据权利要求3所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述维生素混合液与mwmm培养基的体积比为1:900～1100，所述微量元素混合液与mwmm培养基的体积比为1:900～1100。

5.根据权利要求4所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述维生素混合液以超纯水为溶剂，包括如下浓度的组分：氨三乙酸1～2g/l，mgso4·h2o2～4g/l，mnso4·h2o0.4～0.6g/l，nacl0.5～1.5g/l，feso4·7h2o0.05～0.15g/l，cocl2·6h2o0.05～0.15g/l，cacl20.05～0.15g/l，znso4·7h2o0.05～0.15g/l，cuso4·5h2o0.05～0.15g/l，alk(so4)2·12h2o0.005～0.015g/l，h3bo30.005～0.015g/l，na2moo4·2h2o0.005～0.015g/l；

6.根据权利要求5所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述调节培养基ph的组分为硫酸溶液，所述硫酸溶液的浓度为18～22vt％。

7.根据权利要求6所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述fes固体培养基与所述混合培养基的混合体积比为3～5:18～22，所述fes固体培养基由琼脂和fes溶液组成，所述fes溶液的浓度为0.5～1.5g/50ml，所述fes固体培养基中琼脂与fes溶液的比例为1～2g:100ml。

8.根据权利要求7所述的一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述砷污染土壤的含砷量为0.46～1.65g/kg，所述砷污染土壤的含铁量为114～158g/kg，所述砷污染土壤与无菌水的混合比例为1～2g:1～2ml；

9.权利要求1～8任意一项所述的富集培养方法富集得到的嗜酸性微需氧铁氧化菌。

10.权利要求9所述的嗜酸性微需氧铁氧化菌，或者权利要求1～8任意一项所述的富集培养方法富集得到的嗜酸性微需氧铁氧化菌在固定酸性地下水中砷方面的应用。

技术总结
本发明属于治理地下水污染技术领域，本发明提供了一种嗜酸性微需氧铁氧化菌的富集培养方法及其在固定酸性地下水中砷方面的应用。本发明的富集培养方法包括：在MWMM培养基中加入维生素混合液和微量元素混合液，调节培养基pH为4.5，得混合培养基；将FeS固体培养基与所述混合培养基顺次加入培养管中形成反向铁氧浓度梯度，得富集培养基；将砷污染土壤与无菌水混合，得接种液；将所述接种液接种于所述富集培养基中进行富集培养，经过三次传代后得嗜酸性微需氧铁氧化菌。本发明适用于地下水等微需氧环境中砷的固定，利用铁氧化菌的活性可加速铁的生物矿化及其对砷的固定，为地下水污染的治理提供了参考依据。

技术研发人员：王诗忠,李梦瑶,王志炫,张琦,陈驰宇,陈代杰,冯泽楷,陈晓婷,晁元卿,汤叶涛,仇荣亮
受保护的技术使用者：中山大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14