针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用与流程

本发明涉及免疫检测，具体涉及一种针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术：

1、神经丝蛋白(neuroflaments,nf)是构成神经元轴突中间纤维的特异性分子蛋白，是神经元细胞骨架的重要成分，主要定位在成熟神经元的胞体和突起中，负责轴浆运输，维持神经元正常形态及保持神经纤维的弹性，防止断裂。

2、nf包括神经丝三联蛋白(neuroflaments triplet proteins)、α-内切蛋白(α-internexin)、iii型外周蛋白(type iii peripherin)。神经丝三联蛋白由神经丝轻链(又称为“轻肽神经细丝蛋白”，neuroflament light，nefl)、神经丝中链(neuroflamentmiddle,nfm)、神经丝重链(neuroflament heavy，nfh)构成。

3、nefl被认为是神经丝三联蛋白中最重要的一部分，主要因为nefl是唯一可以自我组装成功能性纤维的神经丝蛋白，而神经丝中链和重链蛋白则不能，而且nefl的异常表达及人类nefl基因的突变均会引起多种疾病的发生，大量临床及实验研究指出在多种疾病神经系统的发生、发展过程中nefl的改变更为显著，提示nefl是神经元与轴突损伤的分子标志物，对临床多种疾病的诊断及预后判断有重要指导意义。

4、目前临床研究发现：阿尔兹海默症(ad)患者脑脊液与尿液中nefl水平是升高的，nefl可作为ad的辅助诊断标记物；横断面研究结果表明在症状出现之前，家族性老年痴呆患者血清中nefl浓度是增加的；在阿尔兹海默症和血管性痴呆患者中也发现nefl水平均升高，并且nefl水平与疾病进程呈正相关，血清中nefl可能是早期ad相关神经变性的标志物。

5、除阿尔兹海默症之外，目前研究显示在多数神经受损性疾病中nefl浓度是升高的，如脱髓鞘疾病、创伤性脑损伤、多发性硬化等。

6、在正常人的血清中，人轻肽神经细丝蛋白(nefl)水平的参考范围为pg/ml，属于一个比较低的水平，针对人体样本中人轻肽神经细丝蛋白(nefl)的直接测定具有挑战性，因此开发一种高灵敏度的人轻肽神经细丝蛋白(nefl)检测方法学，具有非常重要的意义。

技术实现思路

1、基于此，有必要提供针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供兔单克隆抗体对1h8和2g10，与人nefl蛋白的亲和力高，利用该高亲和力兔单克隆抗体所建立的双抗夹心法elisa检测方法的灵敏度高，特异性强。

2、本发明采用如下技术方案：

3、本发明提针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体，所述兔单克隆抗体为兔单克隆抗体1h8或兔单克隆抗体2g10，分别结合人nefl蛋白表面的不同抗原决定簇。

4、其中，所述兔单克隆抗体1h8的互补决定区的序列分别如seq id no.3、seq idno.4、seq id no.5、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10所示；所述兔单克隆抗体1h8的轻链可变区的序列如seq id no.2所示，和/或重链可变区的序列如seq id no.7所示。所述兔单克隆抗体1h8的轻链的序列如seq id no.1所示，和/或重链的序列如seq id no.6所示。

5、所述兔单克隆抗体2g10的互补决定区的序列分别如seq id no.13、seq idno.14、seq id no.15、seq id no.18、seq id no.19、seq id no.20所示。所述兔单克隆抗体2g10的轻链可变区的序列如seq id no.12所示，和/或重链可变区的序列如seq idno.17所示。所述兔单克隆抗体2g10的轻链的全长序列如seq id no.11所示，和/或重链的全长序列如seq id no.16所示。

6、本发明还可以提供编码上述针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体的基因序列，或者包含该基因序列的表达载体或者宿主。

7、本发明还可以提供一种标记抗体偶联物，主要由上述针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。

8、本发明提供针对人神经丝蛋白的高亲和力兔单克隆抗体对在建立高灵敏度的人nefl的酶联免疫检测方法中的应用。所述酶联免疫检测方法为双抗夹心法酶联免疫检测方法。所述双抗夹心法酶联免疫检测方法中，捕获抗体为兔单克隆抗体1h8，检测抗体为经生物素标记的兔单克隆抗体2g10。

9、本发明还可以提供一种检测人nefl蛋白的试剂或者试剂盒，包含针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体1h8和2g10。所述人nefl蛋白包括重组表达的人神经丝蛋白，或细胞分泌的人神经丝蛋白，或人血清中的人神经丝蛋白。

10、本发明还可以提供针对人nefl兔单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：将针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293f细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对1h8和2g10的上清液；纯化，即得。

11、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

12、本发明用单个b细胞筛选和培养技术成功开发了高亲和力的抗人nefl的兔单克隆抗体1h8和2g10，抗体1h8和重组表达人nefl结合的亲和常数为2.03×10-9，抗体2g10和重组表达人nefl结合的亲和常数为3.20×10-9。上述两种抗体可以识别人nefl蛋白表面的不同抗原决定簇，可以用于开发双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒；利用该抗体开发的双抗夹心法酶联免疫检测试剂盒，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。该方法学的建立，提供了一种能够在血清、细胞培养基样品中稳定检测极微量水平人nefl蛋白的试剂盒，在临床诊断和科研应用上具有重要的意义。

技术特征：

1.一种针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体包括兔单克隆抗体1h8和兔单克隆抗体2g10，分别结合人nefl蛋白表面的不同抗原决定簇；

2.根据权利要求1所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体1h8的轻链可变区的序列如seq id no.2所示，和/或重链可变区的序列如seq id no.7所示；

3.根据权利要求2所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体，其特征在于，所述兔单克隆抗体1h8的轻链的序列如seq id no.1所示，和/或重链的序列如seq id no.6所示；

4.编码权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体的基因，或者包含该基因的表达载体或者宿主。

5.一种标记抗体偶联物，其特征在于，主要由权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体与荧光标记分子反应制备而成。

6.如权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体在制备检测人nefl蛋白的试剂或者试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂或者试剂盒用于酶联免疫检测人nefl蛋白，其中所述兔单克隆抗体1h8作为捕获抗体，所述兔单克隆抗体2g10用作标记抗体。

8.一种检测人nefl蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，包含权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体1h8和2g10。

9.根据权利要求8所述的检测人nefl蛋白的试剂或者试剂盒，其特征在于，所述人nefl选自重组人nefl蛋白、细胞分泌的人nefl蛋白、血清中的人nefl蛋白中的至少一种。

10.一种权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1至3任一项所述的针对人nefl蛋白的兔单克隆抗体的重链基因、轻链基因分别装载在表达载体上，转染293f细胞；培养获得包含兔单克隆抗体对1h8和2g10的上清液；纯化，即得。

技术总结
本发明提供针对人NEFL蛋白的兔单克隆抗体及其制备方法和应用，具体提供针对人NEFL的高亲和力兔单克隆抗体对，并利用该兔单克隆抗体对开发的双抗夹心ELISA检测方法，具有特异性高、检测灵敏度高等优点。

技术研发人员：刘政泽,吴海,张云,彭晓旺,程昊,娄阳,汤欢欢,代海艳
受保护的技术使用者：武汉爱博泰克生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15