一种胎儿游离DNA的制备方法和用途

本发明涉及医疗检测试剂领域，具体涉及一种胎儿游离dna的制备方法和用途。

背景技术：

1、血浆dna，又称游离dna，是指血液中游离于细胞外的dna，其来源主要有三：白细胞崩解释放的dna、坏死组织特别是肿瘤组织释放入血液的dna和感染病毒、细菌的dna。此外，在孕妇怀孕过程中，胎儿胎盘的部分滋养层细胞会进入孕妇外周血中，破裂并释放游离dna。近几年来，随着基因诊断技术的发展，游离dna的应用价值越来越大，如优生筛查、肿瘤早期诊断、遗传病检测和病原体感染基因检测等。特别的，通过对胎儿游离dna的测序分析可以进行无创产前诊断,也就是常说的无创dna，目前已在产前诊断中获得了广泛应用。

2、胎儿游离dna有两个明显的特征：首先，血浆中胎儿游离dna浓度极低，通常1ml血浆中只能提取出1-100ng人体血浆dna(cfdna)；其次，血浆或血清中的循环dna大多以短片段存在，在250bp以下，不易提取，这大大影响了游离核酸的基因检测和各种研究的开展，此外游离dna含量因个体及胎儿不同，存在较大差异。目前针对人体血浆dna(cfdna)的测试主要有荧光定量pcr、数字pcr、二代测序等，但是由于人体血浆dna(cfdna)提取量太低，在试剂盒研发或实验研究过程中，过多的重复性实验会显著提升荧光定量pcr及数字pcr检测试剂研发成本和实验成本。

技术实现思路

1、因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中难以通过血浆或血清中直接提取到较多的胎儿游离dna的问题，从而提供一种胎儿游离dna的制备方法和用途。

2、为此，本发明提供了一种胎儿游离dna的制备方法，包括如下步骤：分别提取母体静脉血和胎儿滋养层细胞的全基因组，得到提取液；将两组全基因组分别稀释至浓度低于80ng/μl后混合得到混合液，将混合液在功率为60-150w的条件下超声破碎4-6s，停止超声破碎8-12s，重复上述超声破碎和停止破碎操作，当超声破碎总时长为160-240s时停止，即得胎儿游离dna。

3、进一步的，所述破碎总时长为进行超声破碎的时间，不包括停止超声破碎的时间。

4、进一步的，所述提取全基因组前还包括固液分离弃上清的步骤；优选的，所述固液分离为离心或静置。

5、进一步的，所述静置为在4℃下静置1h。

6、进一步的，所述离心转速为1500rpm-3000rpm，离心时间为8-15min。

7、进一步的，所述母体静脉血的全基因组的提取液稀释后的浓度为20-60ng/μl，优选为20-40ng/μl。

8、进一步的，所述胎儿滋养层细胞的全基因组的提取液稀释后的浓度为20-60ng/μl，优选为20-40ng/μl。

9、进一步的，将胎儿滋养层细胞培养至108个/ml-1010个/ml后再提取全基因组。

10、进一步的，所述混合液中胎儿滋养层细胞全基因组与所述母体静脉血全基因组的质量比为1:2.5～1:20。

11、进一步的，所述胎儿游离dna的大小为100～300bp，优选为240～260bp。

12、进一步的，所述稀释过程中采用水为稀释剂。

13、本发明还提供了所述制备方法制得的胎儿游离dna在核酸检测或者在制备用于优生筛查、胎儿肿瘤早期诊断、胎儿遗传病检测或者胎儿病原体感染基因检测的试剂中的应用；优选的，所述试剂可用作质控品或标准品。所述核酸检测为pcr荧光检测或者琼脂糖凝胶电泳测试。

14、本发明技术方案，具有如下优点：

15、1.本发明提供的一种胎儿游离dna的制备方法，包括如下步骤：分别提取母体静脉血和胎儿滋养层细胞的全基因组，得到提取液；将两组全基因组分别稀释至浓度低于80ng/μl后混合得到混合液，将混合液在功率为60-150w的条件下超声破碎4-6s，停止超声破碎8-12s，重复上述超声破碎和停止破碎操作，当超声破碎总时长为160s-240s时停止，即得胎儿游离dna。通过将混合液稀释至20-60ng/μl的混合液，搭配上述特定的超声程序(包括破碎时间、功率、停止时间以及破碎总时间)以及先混合后破碎的方式所制得的dna具有更高的纯度，且产量较高，重复性更好，可用于前期研发以及实验研究中。且该dna制作方法制作流程简单，所用实验设备器材均是实验室常用实验仪器及耗材，易于制作。

16、2.本发明所制备的胎儿游离dna大小为100～300bp，优选为240～260bp，此种大小的片段可以应用于荧光定量pcr及其他dna检测方法中。

技术特征：

1.一种胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，提取全基因组前还包括固液分离弃上清的步骤。

3.根据权利要求2所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述固液分离为离心或静置。

4.根据权利要求1-3中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述母体静脉血的全基因组的提取液稀释后的浓度为20-60ng/μl。

5.根据权利要求1-4中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述胎儿滋养层细胞的全基因组的提取液稀释后的浓度为20-60ng/μl。

6.根据权利要求1-5中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，将胎儿滋养层细胞培养至108个/ml-1010个/ml后提取全基因组。

7.根据权利要求1-6中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述混合液中胎儿滋养层细胞的全基因组与所述母体静脉血的全基因组的质量比为1:2.5～1:20。

8.根据权利要求1-7中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述胎儿游离dna的大小为100～300bp，优选为240～260bp。

9.根据权利要求1-8中任一所述的胎儿游离dna的制备方法，其特征在于，所述稀释过程中采用水为稀释剂。

10.权利要求1-9中任一所述的制备方法所制得的胎儿游离dna在核酸检测或者在制备用于优生筛查、胎儿肿瘤早期诊断、胎儿遗传病检测或者胎儿病原体感染基因检测的检测试剂中的应用；优选的，所述试剂为质控品或标准品。

技术总结
本发明属于医疗检测试剂领域，具体公开了一种胎儿游离DNA的制备方法和用途。具体步骤为：分别提取母体静脉血和胎儿滋养层细胞的全基因组，得到提取液；将两组全基因组的提取液分别稀释至浓度低于80ng/μl后混合得到混合液，将混合液在功率为60‑150W的条件下超声破碎4‑6s，停止超声破碎8‑12s，重复上述破碎和停止破碎操作，当超声破碎总时长为160s‑240s时停止，即得胎儿游离DNA。本发明所制备的胎儿游离DNA提取效率较高，重复性更好，可用于前期研发以及实验研究中。且该DNA制作流程简单，易于制作。

技术研发人员：蔺春茂,殷建,尹焕才
受保护的技术使用者：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13