三维微结构高通量芯片的制备方法及生物试剂筛选方法

本发明涉及生物试剂筛选，尤其涉及一种三维微结构高通量芯片的制备方法及生物试剂筛选方法。

背景技术：

1、癌症、肿瘤、异位症等疾病的发病根源都是从病变的细胞开始的，因此针对病变细胞的药物筛选是筛药的一个关键环节。目前用于药物筛选的细胞芯片大多数是二维细胞培养，二维设计不能反映细胞的原始环境，它们在药物筛选和临床应用中只有有限的价值。最近，也有少数研究设计了用于药物筛选的三维细胞芯片，但其被设计成了具有微流体通道的由聚二甲基硅氧烷(pdms)的橡胶材料制成，不能模拟天然的细胞环境。也有一些团队将材料改进成了一种新的凝胶称为聚乙烯乙二醇二丙烯酸酯(pegda)来创建他们自己的芯片，从而控制化学药物的智能释放。但是这些材料却丢失了细胞在体内环境的一些生物学特性。

技术实现思路

1、本申请的发明人发现，病变细胞与细胞外基质的相互作用，包括粘附、侵袭、迁移等都是癌症、肿瘤、异位症等疾病发生和发展的关键，因此病变细胞与细胞外基质的相互作用的定量化表征将成为药物筛选的关键。基于粒子图像测速法(piv)的牵引力显微镜(tfm)技术可以将细胞与胶原基质的相互作用进行实时的定量化测量，从而可以得到不同时段细胞对胶原的牵引力。并且，一型胶原是人体中最丰富的胶原蛋白，使用这种材料可以高度模拟细胞在体内所处的环境，更有利于研究细胞-基质的相互作用。因此，将一型胶原高通量芯片与tfm技术相结合，设计出了一种可以量化细胞与基质作用强弱的高通量的筛药平台，既可以筛选出有效的药物种类，又可以对药物的最佳作用剂量进行定量化筛选。

2、本发明的一个目的在于设计出一种生物三维微结构高通量芯片，以用于细胞力学层面的生物试剂筛选。

3、本发明的一个进一步的目的在于可以筛选出有效的生物试剂，又可以对生物试剂的最佳作用剂量进行定量化筛选。

4、特别地，本发明提供了一种三维微结构高通量芯片的制备方法，包括如下步骤：

5、提供柔性生物材料原液和具有微结构阵列的三维高通量的pdms芯片模板；

6、制备杨氏模量类似于体内组织杨氏模量的柔性生物材料原液和荧光微球的混合溶液；

7、吸取部分所述混合溶液，并将其施加至小孔玻璃培养基材中；

8、在所述pdms芯片模板上施加所述混合溶液，使得柔性生物材料保留在所述pdms芯片模板的表面；

9、将所述pdms芯片模板的具有所述柔性生物材料的一侧覆盖在所述小孔玻璃培养基材中的所述混合溶液上，并放置在细胞培养箱内，静置使得所述柔性生物材料固化；

10、将固化后的所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离，从而得到由所述柔性生物材料构成的生物三维微结构高通量芯片。

11、可选地，所述吸取部分所述混合溶液，并将其施加至小孔玻璃培养基材的步骤中，所述混合溶液能够铺满所述小孔玻璃培养基材的玻璃凹槽。

12、可选地，所述将所述pdms芯片模板的具有所述柔性生物材料的一侧覆盖在所述小孔玻璃培养基材中的所述混合溶液上，并将放置在细胞培养箱内，静置使得所述柔性生物材料固化的步骤中，静置的条件为在35-40℃下静置30-40min。

13、可选地，所述将固化后的所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离，从而得到由所述柔性生物材料构成的生物三维微结构高通量芯片的步骤中，向所述小孔玻璃培养基材中加入1×pbs缓冲液，从而将所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离。

14、可选地，所述将固化后的所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离，从而得到由所述柔性生物材料构成的生物三维微结构高通量芯片的步骤中，还包括如下步骤：去除所述小孔玻璃培养基材中的1×pbs缓冲液，加入细胞用基础培养基。

15、特别地，本发明还提供了一种生物试剂筛选方法，包括如下步骤：

16、提供待检测细胞，并根据检测需求对所述待检测细胞进行活细胞染色；

17、对所述待检测细胞进行计数，并稀释至浓度为1×104_10×104个/ml；

18、在如前述的制备方法制备得到的生物三维高通量微结构芯片内加入染色后的所述待检测细胞，并放置在细胞培养箱内；

19、利用牵引力显微镜成像技术定量分析所述待检测细胞对所述生物三维微结构高通量芯片的牵引力；

20、向具有所述待检测细胞的所述生物三维微结构高通量芯片加入生物试剂，利用牵引力显微成像技术定量分析加入所述生物试剂后所述待检测细胞对所述生物三维微结构高通量芯片的牵引力，从而筛选出所述生物试剂的作用效果。

21、可选地，所述提供待检测细胞，并对所述待检测细胞进行染色的步骤中，利用活细胞染料对所述待检测细胞进行染色标记。

22、可选地，所述在如前述的制备方法制备得到的生物三维微结构高通量芯片内加入所述待检测细胞，并放置在细胞培养箱内的步骤中，所述生物三维微结构高通量芯片的每个微结构重复单元内具有1-5个所述待检测细胞。

23、可选地，利用牵引力显微成像技术定量分析加入所述生物试剂之前或之后所述待检测细胞对所述生物三维微结构高通量芯片的牵引力之前，还包括如下步骤：

24、将样品放入倒置荧光显微镜的活细胞工作站中；

25、对所述生物三维微结构高通量芯片内的待检测细胞进行多位点选取；

26、对选取的多位点进行连续时间序列多荧光通道拍照；

27、提取出荧光微球所在通道的时间序列图片。

28、根据本发明的方案，设计出了一种全新的生物三维微结构高通量芯片，为实现对炎症因子、小分子药物、多肽、抗体等各种细胞粘附、侵袭等力学相关的试剂、药剂进行筛选的目的提供了基础。

29、进一步地，本发明的生物试剂筛选方法，既可以筛选出有效的药物种类，又可以对药物的最佳作用剂量进行定量化筛选，并且方法简单、高效以及准确度高。

30、根据下文结合附图对本发明具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本发明的上述以及其他目的、优点和特征。

技术特征：

1.三维微结构高通量芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述吸取部分所述混合溶液，并将其施加至小孔玻璃培养基材的步骤中，所述混合溶液能够铺满所述小孔玻璃培养基材的玻璃凹槽。

3.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述将所述pdms芯片模板的具有所述柔性生物材料的一侧覆盖在所述小孔玻璃培养基材中的所述混合溶液上，并将放置在细胞培养箱内，静置使得所述柔性生物材料固化的步骤中，静置的条件为在35-40℃下静置30-40min。

4.根据权利要求1-2中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述将固化后的所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离，从而得到由所述柔性生物材料构成的生物三维微结构高通量芯片的步骤中，向所述小孔玻璃培养基材中加入1×pbs缓冲液，从而将所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述将固化后的所述柔性生物材料与所述pdms芯片模板分离，从而得到由所述柔性生物材料构成的生物三维微结构高通量芯片的步骤中，还包括如下步骤：去除所述小孔玻璃培养基材中的1×pbs缓冲液，加入细胞用基础培养基。

6.一种生物试剂筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.根据权利要求6所述的生物试剂筛选方法，其特征在于，所述提供待检测细胞，并对所述待检测细胞进行染色的步骤中，利用活细胞染料对所述待检测细胞进行染色标记。

8.根据权利要求6所述的生物试剂筛选方法，其特征在于，所述在如权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的生物三维微结构高通量芯片内加入所述待检测细胞，并放置在细胞培养箱内的步骤中，所述生物三维微结构高通量芯片的每个微结构重复单元内具有1-5个所述待检测细胞。

9.根据权利要求6-8中任一项所述的生物试剂筛选方法，其特征在于，利用牵引力显微镜成像技术定量分析加入所述生物试剂之前或之后所述待检测细胞对所述生物三维微结构高通量芯片的牵引力之前，还包括如下步骤：

技术总结
本发明提供了一种三维微结构高通量芯片的制备方法及生物试剂筛选方法。该制备方法包括如下步骤：提供柔性生物材料原液和具有微结构阵列的三维高通量的PDMS芯片模板；制备柔性生物材料原液和荧光微球的混合溶液；吸取部分混合溶液，并将其施加至小孔玻璃培养基材中；在PDMS芯片模板上施加混合溶液，使得柔性生物材料保留在PDMS芯片模板的表面；将PDMS芯片模板的具有柔性生物材料的一侧覆盖在小孔玻璃培养基材中的混合溶液上，并放置在细胞培养箱内，静置使得柔性生物材料固化；将固化后的柔性生物材料与PDMS芯片模板分离，从而得到生物三维微结构高通量芯片。本发明方案可以进行细胞力学特性定量分析，从而筛选出有效生物试剂及其最佳作用剂量。

技术研发人员：叶方富,高警蔚,樊琪慧
受保护的技术使用者：中国科学院物理研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13