一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统、构建方法及其应用与流程

本发明涉及一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸fpp的报告系统、构建方法及其应用，并公开了其基因的核苷酸序列、氨基酸序列、蛋白结构，报告系统在不同fpp水平以及不同发酵时间下的响应效果，属于生物工程。

背景技术：

1、异戊二烯类化合物存在于所有生物体中，是最多样化的天然物质之一。目前已知至少有50，000种结构，其中许多结构在医疗和技术应用方面具有巨大潜力。在异戊二烯形成的一类最为重要的代谢物：萜烯类化合物中存在一个中心代谢物质：法尼基焦磷酸fpp，fpp作为合成倍半萜烯的关键性前体，参与包括胡萝卜素、番茄红素、罗汉果苷等多种高附加值产品。

2、随着生物技术的发展,合成生物学受到越来越多的关注。通过在微生物底盘细胞中重组天然化合物的生物合成途径，来快速、大量的获取天然产物及其中间体，为植物天然活性产物的开发与应用提供了新的方法。微生物具有生长速度快、发酵周期短、发酵成本低的优点，且相对于植物其遗传背景更清楚有利于遗传改造。基于这些优点，多种萜烯类化合物已成功在微生物底盘中生产，而想要在微生物底盘中更加高效地进行生产，精准的调控和检测细胞内的fpp含量就至关重要，基于这一需求，我们开发了一种使用分裂式荧光蛋白检测fpp的方法。

技术实现思路

1、本发明的目的是构建一种能够在细菌中快速响应法尼基焦磷酸fpp的报告系统并将其工业化应用。该报告系统由两个独立表达的蛋白fppr1和fppr2构成。将两个蛋白以基因簇的形式转化至e.coli bl21(de3)感受态细胞中构建获得。

2、为实现上述目的,本发明采取的技术方案如下：

3、该报告系统通过如下步骤构建获得：

4、构建组成性表达fppr的重组质粒：

5、(1)分别合成插入了fpp结合序列的麦芽糖结合蛋白及其锚定蛋白,其核苷酸序列如seq id no.1、seq id no.2所示，其氨基酸序列如seq id no.3、seq id no.4所示。

6、(2)分别合成β-桶蛋白的n端以及c端序列，其核苷酸序列如seq id no.5、seq idno.6所示，其氨基酸序列如seq id no.7、seq id no.8所示。

7、(3)将步骤(1)及(2)扩增得到的麦芽糖结合蛋白与β-桶蛋白的n端连接,获得fppr1；将步骤(1)及(2)扩增得到的锚定蛋白与β-桶蛋白的c端连接，获得fppr2；fppr1、fppr2的序列如seq id no.9、seq id no.10所示。

8、(4)根据具体使用环境，选择具有合适强度的组成性启动子，将fppr1、fppr2串联表达，并转入用于生产的底盘菌株使用。

9、本发明的有益效果是：本发明构建的传感器在野生型大肠杆菌bl21以及过表达fpp生产途径的大肠杆菌bl21-mva中分别验证了可用性，该方法适于工业化生产中fpp的实时检测。

技术特征：

1.一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸fpp的报告系统，其特征在于，

2.一种权利要求1所述的报告系统的构建方法，其特征在于，构建组成性表达fppr的重组质粒，

3.一种如权利要求2所述的构建方法的应用，其特征在于，通过在工程菌株中表达fppr以检测菌株fpp表达，具体为：将上述fppr1、fppr2序列在工程菌株中组成性表达，并于6h发酵后使用酶标仪/流式细胞仪进行荧光检测。具体参数为ex 492nm，em 510nm。

技术总结
本发明公开了一种用于细菌中快速响应法尼基焦磷酸FPP的报告系统、构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。所述报告系统由两个独立表达的蛋白FPPR1和FPPR2构成，将两个蛋白以基因簇的形式转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中构建获得。本发明构建的传感器在野生型大肠杆菌BL21(DE3)以及过表达FPP生产途径的大肠杆菌BL21‑MVA中分别验证了可用性。本发明实现了对菌株中FPP的实时检测，适用于工业化生产。

技术研发人员：李思远,尤大伟,王玉祺
受保护的技术使用者：苏州微星博生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16