四价流感病毒料液制备方法、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法与流程

本发明涉及流感疫苗领域，具体涉及了一种四价流感病毒料液制备方法、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。

背景技术：

1、鸡胚培养流感病毒（以下简称鸡胚法）是四价流感病毒疫苗生产传统的培养方法之一，应用至今已超过40余年，目前仍然是预防全球流感大流行最主要、快速的生产工艺。鸡胚法常规工艺系将流感病毒经磷酸盐缓冲液适宜稀释后，注射至9～11胚龄鸡胚的尿囊腔，经33～35℃孵育2～3天时间后，病毒得到大量繁殖，再放置2～8℃超过24小时冷却胚蛋内血管后，收获尿囊液，从而获得流感病毒料液。该方法虽然成熟，存在鸡群对四型流感病毒的敏感性不一致、流感病毒在鸡胚上复制效果差别大、常规冷胚工艺使得病毒料液中的杂质较多，影响病毒料液质量和产量，不利于后续纯化的缺点。

2、经查阅，相似的解决方案如下：

3、①《一种鸡胚接种用病毒稀释液及其制备方法和应用》（中国发明专利公开号cn1110576883a）公开：流感病毒在接种至鸡胚前，稀释病毒用的磷酸盐缓冲液中添加地塞米松、胰蛋白酶、氨基酸、维生素等物质，可促进病毒在鸡胚中的快速大量增殖，提高鸡胚液中的病毒滴度。从理论上分析，该方案单方面降低病毒在鸡胚中增殖的个体差异性，但没有在物种层面上整体提高鸡群对四个型别流感病毒的敏感性，两者协同作用更优地提高病毒料液的质量和产量。此外，地塞米松、胰蛋白酶仍没有应用到人用流感疫苗生产中，不利于推广使用。

4、②《同胚接种、同步增殖鸡新城疫和禽流感复合病毒的方法》（中国发明专利公开号cn113073085a）公开：流感病毒和鸡新城疫病毒同步在接种至鸡胚前，稀释病毒用的溶液为2~5%犊牛血清乳汉液或0.5%乳汉液，后续病毒采用常见的温度进行培养及冷胚，收获的病毒单胚平均收获量大，提高了生产效率，降低了生产成本。从理论上分析，该方案中病毒稀释液添加的牛血请，本身具有疯牛病病毒的潜在危险，与《中国药典》对病毒类疫苗生产质量管理要求的理念相违背，不利于推广使用。

5、③《四价流感病毒鸡胚培养工艺、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法》（中国发明专利公开号cn113817688a）公开：病毒采用含2~5%蔗糖的磷酸盐缓冲液稀释，经鸡胚上培养后，鸡胚先放置于-20±5℃，冷冻0.5~1.5小时，然后转至2~8℃冷胚5~10小时，可大幅缩短生产工艺时间，并提高收获液的血凝滴度（10.03±0.46 log2）和病毒滴度，降低蛋白含量（1.81±0.14mg/ml），使得料液更澄清。从理论上分析，该方案单方面降低病毒在鸡胚中增殖的个体差异性，但放置-20±5℃容易让最先冷冻的尿囊液形成冰晶，非常损害病毒活性，而且该方法没有在物种层面上和培养条件方面整体提高鸡群对四个型别流感病毒的敏感性，协同作用更优地提高病毒料液的质量和产量。

6、由上可知，现有技术缺点如下：

7、（1）鸡群对四型（h1n1、h3n2、bv、by）流感病毒的敏感性差异较大：鸡群对不同亚型流感病毒具有不同水平的群体免疫力，使得四型病毒在其胚蛋上的增殖效果不同，获得病毒液的血凝效价、病毒滴度差异较大，不利于多价流感病毒疫苗的生产。

8、（2）流感病毒在鸡胚上复制效果差别大：鸡胚存在个体发育差异现象，即使同一亚型流感病毒在同一批鸡胚上进行复制，单胚个体获得的病毒血凝效价水平也是参差不齐，影响病毒料液整体的质量。

9、（3）常规冷胚工艺时间较长，且得到的病毒料液中的杂质如卵清、鸡血细胞等较多，影响病毒收获液质量，且极其影响后续纯化工作的开展。

技术实现思路

1、为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种四价流感病毒料液制备方法、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。本发明四价流感病毒料液制备方法有效解决传统鸡胚法中鸡群对四型流感病毒的敏感性不一致，且流感病毒在鸡胚上复制效果差别大，收获时常规冷胚工艺时间长，病毒料液中的杂质多，造成的批间差异大，不利于后续纯化的缺点。

2、本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

3、第一方面，一种四价流感病毒料液制备方法，其包括以下步骤：根据不同亚型的流感病毒选用不同品种的鸡胚，采用不同病毒稀释液稀释病毒后选择不同接种量接种至鸡胚尿囊腔；依次采用低温、高温进行病毒培养，然后采用冷冻再冷藏的冷胚步骤。

4、第二方面，一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其采用上述方法制备的四价流感病毒料液。

5、第三方面，一种四价流感病毒裂解疫苗，其通过上述方法制备得到。

6、本发明具有如下有益效果：

7、通过本发明四价流感病毒料液制备方法，可获得以下效果：

8、（1）提高四型（h1n1、h3n2、bv、by）流感病毒料液质量，并使其保持均一性，不同亚型病毒滴度最高可达9.7 lg eid50/ml、9.5 lg eid50/ml、9.0 lg eid50/ml、9.0 lgeid50/ml，血凝效价均在1:960~1:1120之间；

9、（2）提高流感病毒单胚产量，不同亚型病毒单胚产量依次提高6.4%、4.3%、8.4%和9.6%；

10、（3）冷胚工艺缩短12h，大大提高生产效率；

11、（4）同时减少病毒料液杂质，离心纯化的比浊值依次提高了7%、12%、5%和7%，更利于后续纯化工作的开展。

技术特征：

1.一种四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：根据不同亚型的流感病毒选用不同品种的鸡胚，采用不同病毒稀释液稀释病毒后选择不同接种量接种至鸡胚尿囊腔；依次采用低温、高温进行病毒培养，然后采用冷冻再冷藏的冷胚步骤。

2.根据权利要求1所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，所述根据不同亚型的流感病毒选用不同品种的鸡胚具体是指：h1n1型病毒选用京白品种鸡群的10~10.5日龄鸡胚，h3n2型病毒选用联安海兰白品种鸡群的10~10.5日龄鸡胚，乙型bv和by系病毒均选用京粉品种鸡群的9.5~10.0日龄鸡胚；以上所有鸡群的血清hi抗体效价≤1:4。

3.根据权利要求2所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，所述采用不同病毒稀释液稀释病毒具体是指：针对h1n1和h3n2型病毒的病毒稀释液包括0.01~0.025%葡聚糖硫酸钠、0.1~0.3%人血白蛋白、0.2~0.5%维生素c、0.1~0.2%维生素e的磷酸盐缓冲液，ph为7.6~7.8；针对乙型bv和by系病毒的病毒稀释液包括0.01~0.025%葡聚糖硫酸钠、0.1~0.3%人血白蛋白、0.2~0.5%维生素c、0.1~0.2%维生素e的磷酸盐缓冲液，ph为7.8~8.0。

4.根据权利要求3所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，所述选择不同接种量接种至鸡胚尿囊腔具体是指：针对h1n1和h3n2型病毒的接种量为105~106eids/ml，0.1~0.3ml/胚；针对乙型bv和by系病毒的接种量为104~105eids/ml，0.1~0.3ml/胚。

5.根据权利要求1至4任一所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，所述依次采用低温、高温进行病毒培养具体是指：

6.根据权利要求5所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，h1n1和h3n2型病毒全程培养时间不超过48小时；乙型bv和by系病毒全程培养时间不超过72小时。

7.根据权利要求5所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，所述采用冷冻再冷藏的冷胚步骤具体是指：

8.根据权利要求7所述的四价流感病毒料液制备方法，其特征在于，h1n1和h3n2型病毒全程冷胚时间不超过12小时；乙型bv和by系病毒全程冷胚时间不超过12小时。

9.一种四价流感病毒裂解疫苗的制备方法，其特征在于，采用如权利要求1-8中任一项所述方法制备的四价流感病毒料液。

10.一种四价流感病毒裂解疫苗，其特征在于，通过如权利要求9所述的方法制备得到。

技术总结
本发明公开了一种四价流感病毒料液制备方法、四价流感病毒裂解疫苗及其制备方法。四价流感病毒料液制备方法包括以下步骤：根据不同亚型的流感病毒选用不同品种的鸡胚，采用不同病毒稀释液稀释病毒后选择不同接种量接种至鸡胚尿囊腔；依次采用低温、高温进行病毒培养，然后采用冷冻再冷藏的冷胚步骤。本发明有效解决传统鸡胚法中鸡群对四型流感病毒的敏感性不一致，且流感病毒在鸡胚上复制效果差别大，收获时常规冷胚工艺时间长，病毒料液中的杂质多，造成的批间差异大，不利于后续纯化的缺点。

技术研发人员：罗姗,刘依润,徐江波,王雪云,郭土敬,王义民,刘栩祥,梁琳琳,刘永娣,赖婵丹
受保护的技术使用者：深圳市卫光生物制品股份有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13