高产糖的黑醋酸菌的筛选方法与流程

本发明属于黑醋酸菌生产，具体涉及高产糖的黑醋酸菌的筛选方法。

背景技术：

1、黑醋酸菌，醋酸单胞菌属，是椭圆形短杆菌，有鞭毛，不生芽孢，为好气性氧化型细菌，革兰氏染色阴性，液体表面培养，可以形成菌膜二攀附与瓶壁上，振摇即可破碎，适用于偏酸性条件下生长，能将葡萄糖、酒精氧化成酸，将山梨醇氧化为山梨糖。利用黑醋酸菌的这一特性，应用于工业生产一步发酵过程中，将山梨醇氧化为山梨糖。

2、因此生产上要求黑醋酸菌具备较高的产糖效率，通常会对黑醋酸菌进行筛选，得到高产糖的菌种，通常是通过重复多次筛选，使用含有碳酸钙的选择培养基，利用黑醋酸菌的融钙性质，对黑醋酸菌进行筛选，但该筛选方法效率低，一方面，重复多次筛选的用时较长，另一方面，使用选择培养基筛选需依靠人为主观评价融钙圈特征，进行选择，多次筛选则必然导致主观因素过多，影响最终的筛选结果，无法得到最佳产糖效率的菌种，并且不同时间筛选的菌种产糖效率不稳定。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了高产糖的黑醋酸菌的筛选方法，对黑醋酸菌进行离子注入，缩短了菌种筛选的时间，得到高产糖的黑醋酸菌。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、本发明所述的高产糖的黑醋酸菌筛选方法，是对黑醋酸菌进行离子注入。

4、离子注入的瞬时光通量为10~15，优选15。

5、离子注入的离子总量为2000~4000，优选4000。

6、离子注入过程中，真空度5.0e-2~9.0e-3，灯丝电流15~30a、灯丝电压15~25v，磁场电流3~5a，阳极电压130~150v，阳极电流2~5a；优选，真空度1.0e-2，灯丝电流30a，灯丝电压17v，磁场电流4~5a。

7、所述高产糖的黑醋酸菌的筛选方法，具体包括以下步骤：

8、（1）将原菌种进行扩大培养，得到菌液；

9、（2）将菌液用无菌水稀释后得到菌悬液，将菌悬液涂布于平板培养基上，形成菌膜；

10、（3）将平板培养基置于离子注入机中，进行离子注入；

11、（4）离子注入结束后，使用无菌水将菌膜洗脱，涂布于分离培养基进行培养，菌落周围形成融钙圈；

12、（5）根据菌落和融钙圈的形态进行筛选，得到所述高产糖的黑醋酸菌。

13、步骤（2）中，稀释菌液采用梯度稀释1000倍，三次稀释，每次稀释十倍。

14、步骤（3）中，离子注入参数设置原则，先确定瞬时光通量与离子总量，由于一次离子注入操作过程中，钨合金灯丝通电后，通过阳极电压产生热量，经过磁场给予其初速度，通过加速由内孔将电离的离子注入至小靶室，但是，随着灯丝温度的变化，电阻发生变化，所需能量也随之变化，所以需要调整其他参数来保证瞬时光通量的稳定，因此，瞬时光通量的稳定是通过在离子注入过程中动态调整其他参数来维持的，其他参数为灯丝电流、灯丝电压、磁场电流、阳极电压、阳极电流；通常维持灯丝电流和灯丝电压不变，调整磁场电流、阳极电压和阳极电流。

15、步骤（4）中，分离培养基的组成成分为山梨醇10%、酵母膏0.7%、碳酸钙1%、琼脂2.5%，其余为水，ph为5.2~5.4。

16、步骤（5）中，筛选原则是：融钙圈清晰、规则、大，菌体饱满、规则、有光泽度；得到所述高产糖的黑醋酸菌后，可对其进行扩大培养，保藏或用于生产。

17、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

18、1.本发明通过对于黑醋酸菌进行离子注入，缩短了菌种筛选的时间。本发明方法仅包括扩大培养、离子注入、分离培养三部分即可得到高产糖的黑醋酸菌，相较于传统的筛选方法，不需要多次重复的筛选过程，极大缩短了筛选时间。

19、2.本发明限定了最佳的瞬时光通量，可有效剔除活性较差的菌体，最大程度的筛选得到活性强的菌体，同时，限定了最佳的离子总量，随着对离子总量的计量不断增多，留存的菌体活性增强，也不会因离子过量对菌体造成损伤，从而得到高产糖的黑醋酸菌。

20、3.本发明通过控制离子注入的参数设置，减少了人为因素的干扰，因此，不同时间筛选的菌种产糖效率较为稳定。

21、4.本发明方法筛选高产糖的黑醋酸菌，黑醋酸菌未发生基因突变、形态变异等情况，可针对黑醋酸菌进行定期的菌种鉴定，保证黑醋酸菌的遗传稳定性。

技术特征：

1.一种高产糖的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：所述方法是对黑醋酸菌进行离子注入。

2.根据权利要求1所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：离子注入的瞬时光通量为10~15。

3.根据权利要求2所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：离子注入的离子总量为2000~4000。

4.根据权利要求3所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：离子注入过程中，真空度5.0e-2~9.0e-3，灯丝电流15~30a、灯丝电压15~25v，磁场电流3~5a，阳极电压130~150v，阳极电流2~5a。

5.根据权利要求4所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：所述高产糖的黑醋酸菌的筛选方法，具体包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：步骤（2）中，稀释菌液采用梯度稀释1000倍。

7.根据权利要求5所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：步骤（4）中，分离培养基的组成成分为山梨醇10%、酵母膏0.7%、碳酸钙1%、琼脂2.5%，其余为水，ph为5.2~5.4。

8.根据权利要求5所述的黑醋酸菌筛选方法，其特征在于：步骤（5）中，筛选原则是：融钙圈清晰、规则、大，菌体饱满、规则、有光泽度。

技术总结
本发明属于黑醋酸菌生产技术领域，具体涉及高产糖的黑醋酸菌的筛选方法。本发明所述筛选方法，是对黑醋酸菌进行离子注入，其中，离子注入的瞬时光通量为10~15，离子注入的离子总量为2000~4000；离子注入过程中，真空度5.0E‑2~9.0E‑3，灯丝电流15~30A、灯丝电压15~25V，磁场电流3~5A，阳极电压130~150V，阳极电流2~5A；离子注入后再根据菌落和融钙圈的形态进行筛选，得到所述高产糖的黑醋酸菌。本发明通过对黑醋酸菌进行离子注入，缩短了菌种筛选的时间，得到了高产糖的黑醋酸菌。

技术研发人员：冯帅,冯根玲,冯春晓
受保护的技术使用者：鲁维制药集团有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15