一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标、LMTIA引物对、试剂盒、检测方法及应用

本发明涉及分子生物学应用，具体涉及一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标、lmtia引物对、试剂盒、检测方法及应用。

背景技术：

1、克罗诺杆菌(cronobacter spp.)广泛存在于婴幼儿奶粉米粉、肉类、饮用水和蔬菜中，可引起菌血症、脑膜炎、坏死性小肠结肠炎等疾病。克罗诺杆菌属包括7个种：阪崎克罗诺杆菌(c.sakazakii)、丙二酸盐克罗诺杆菌(c.malonaticus)、莫金斯克罗诺杆菌(c.muytjinii)、苏黎世克罗诺杆菌(c.turicensis)、康帝蒙提克罗诺杆菌(c.condiment)、尤尼沃斯克罗诺杆菌(c.unisails)和都柏林克罗诺杆菌(c.dublinensis)。克罗诺杆菌属7个种都可以导致人类致病，丙二酸盐克罗诺杆菌是仅次于阪崎克罗诺杆菌的致病种类。

2、目前可用于检测食品中丙二酸盐克罗诺杆菌的方法主要有传统微生物培养法，免疫学检测法和分子生物学检测法。传统检测方法基于平板计数法，检测周期一般为5～7天，劳动量较大，而且特异性不高，容易导致检测的假阳性。免疫学检测法通常需要较为昂贵的设备和较长的检测时间，无法满足快速检测的要求。相比于传统培养法，基于核酸技术发展起来的检测方法正成为快速检测该菌的热点，而寻找到丙二酸盐克罗诺杆菌特异性核酸靶点是相关检测技术开发的核心。

3、目前研究较多的主要是以16srrna基因为靶标检测丙二酸盐克罗诺杆菌，但是16srrna特异性不高，故亟需研发新的特异性强的检测靶标。而针对于丙二酸盐克罗诺杆菌核酸检测的相关基因数量少且特异性不强，不能有效的将其与克罗诺属的其他菌种及亲缘关系较近的一些杆菌区分开。因此，筛选到具有高特异性新核酸靶点，以及建立一种特异性强、假阳性少的检测丙二酸盐克罗诺杆菌的方法，对保障婴儿配方食品的安全性具有非常重要的意义。目前用于检测食品中丙二酸盐克罗诺杆菌的分子生物学检测法主要为pcr技术和lamp技术。但由于pcr技术需要三个温度的循环，扩增仪器的温控不容易实现，所以基于pcr技术的仪器较为复杂昂贵，加热耗能大；而lamp技术一般需要相对较长6个引物，引物设计难度高，试剂成本也相应高。因此，丙二酸盐克罗诺杆菌检测方法的引物设计复杂、仪器设备复杂且核酸靶点特异性不高的问题亟待解决。

技术实现思路

1、本发明的主要目的是提出一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标、lmtia引物对、试剂盒和检测方法以及应用，旨在解决丙二酸盐克罗诺杆菌检测方法的引物设计复杂、仪器设备复杂且核酸靶点特异性不高的问题。

2、为实现上述目的，本发明提出一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标，所述新靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。

3、本发明还提出了一种用于检测丙二酸盐克罗诺杆菌的lmtia引物对，所述lmtia引物对由基于上述丙二酸盐克罗诺杆菌新靶标设计得到，包括：

4、上游引物ompr-p，所述上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、下游引物ompr-d，所述下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

6、可选地，所述上游引物ompr-p包括引物p1和引物p2；

7、所述下游引物ompr-d包括引物d1和引物d2；

8、其中，所述引物p1和引物d2与所述新靶标核苷酸序列的负链互补，所述引物p2和引物d1与所述新靶标核苷酸序列的正链互补；

9、所述引物p1的核苷酸序列如seq id no.4所示；

10、所述引物p2的核苷酸序列如seq id no.5所示；

11、所述引物d1的核苷酸序列如seq id no.6所示；

12、所述引物d2的核苷酸序列如seq id no.7所示。

13、本发明还提出了一种丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，包括步骤：

14、获取待检dna样品；

15、利用上述的lmtia引物对对所述获取的dna样本进行lmtia扩增反应，得到扩增反应产物；

16、获取扩增反应产物的特征值；

17、根据扩增反应产物的特征值判断待检dna样品是否存在阳性扩增。

18、可选地，根据扩增反应产物的特征值判断反应产物中dna样品是否存在阳性扩增的步骤包括：

19、获取扩增反应产物的颜色；

20、若反应产物的颜色为蓝色，则判断待检dna样品存在阳性扩增。

21、可选地，根据扩增反应产物的特征值判断反应产物中dna样品是否存在阳性扩增的步骤包括：

22、获取扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；

23、若扩增反应产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果为有梯形带，则判断待检dna样品存在阳性扩增。

24、可选地，所述lmtia反应体系包括：

25、1/2粒bst 4.0hnb bead；

26、1μl的上游引物ompr-p；

27、1μl的下游引物ompr-d；

28、1μl的模板dna；

29、22μl的ddh2o。

30、可选地，所述上游引物ompr-p的浓度均为10mm/μl；和/或，

31、所述下游引物ompr-p的浓度均为10mm/μl；和/或，

32、所述lmtia反应的反应温度为60℃～70℃；和/或，

33、反应时间为30～50min。

34、本发明还提出了一种用于检测丙二酸盐克罗诺杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括上述的lmtia引物对。所述lmtia引物对由基于上述新靶标设计得到，包括：

35、上游引物ompr-p，所述上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示；

36、下游引物ompr-d，所述下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

37、本发明还提供了上述lmtia引物对在非诊断目的的检测丙二酸盐克罗诺杆菌中的应用。所述lmtia引物对由基于上述新靶标设计得到，包括：

38、上游引物ompr-p，所述上游引物核苷酸序列如seq id no.2所示；

39、下游引物ompr-d，所述下游引物核苷酸序列如seq id no.3所示。

40、本发明利用丙二酸盐克罗诺杆菌采用ompr基因作为检测新靶标设计得到的高度匹配的lmtia引物对，利用所述的lmtia引物对对所述获取的dna样本进行lmtia扩增反应，获取扩增反应产物的特征值并根据扩增反应产物的特征值判断待检dna样品是否存在阳性扩增。由于ompr基因具有更强的特异性，本发明采用lmtia扩增技术检测丙二酸盐克罗诺杆菌时，有特异性强的效果，同时检测时采取lmtia扩增技术，引物设计简单，设备需求简单，且能做到可视化观察扩增结果。因此本发明提供的丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法具有引物设计简单、设备需求简单且核酸靶点特异性高的技术效果。

技术特征：

1.一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标，所述新靶标的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种用于检测丙二酸盐克罗诺杆菌的lmtia引物对，其特征在于，所述lmtia引物对由基于权利要求1所述的新靶标设计得到，所述lmtia引物对包括：

3.如权利要求2所述的lmtia引物对，其特征在于，

4.一种丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，其特征在于，包括步骤：

5.如权利要求4所述的丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，其特征在于，根据扩增反应产物的特征值判断反应产物中dna样品是否存在阳性扩增的步骤包括：

6.如权利要求4所述的丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，其特征在于，根据扩增反应产物的特征值判断反应产物中dna样品是否存在阳性扩增的步骤包括：

7.如权利要求4所述的丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，其特征在于，所述lmtia反应体系包括：

8.如权利要求7所述的丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法，其特征在于，

9.一种用于检测丙二酸盐克罗诺杆菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2或3所述的lmtia引物对。

10.权利要求2或3所述的lmtia引物对在非诊断目的的检测丙二酸盐克罗诺杆菌中的应用。

技术总结
本发明公开了一种检测丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标、LMTIA引物对、试剂盒、检测方法及应用，本发明属于分子生物学应用技术领域。本发明提供了用于阪崎克罗诺杆菌检测的新靶标，利用该靶标设计LMTIA引物，并以样本DNA作为底物进行LMTIA扩增反应，在恒温条件下扩增一段时间后，判断反应产物中DNA样品是否存在阳性扩增。本发明提出的一种丙二酸盐克罗诺杆菌的新靶标具有高度的特异性。本发明提供的检测丙二酸盐克罗诺杆菌的检测方法具有引物设计简单、设备需求简单且核酸靶点特异性高的技术效果。

技术研发人员：李睿,马达,毕旺来,翟平平,朱应飞,章洁
受保护的技术使用者：武汉轻工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15