基于数字PCR检测鼻咽癌中EB病毒的引物探针组合的制作方法

本发明涉及医学检测，具体涉及一种用于检测eb病毒的引物组合及其试剂盒。

背景技术：

1、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,npc)是来源于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，主要流行于中国南部、东南亚及非洲北部等地区。鼻咽癌发病分布具有独特的地域特点，其高发于我国南方地区，尤其是在两广的分布呈现典型的聚集的现象，具有代表性的有广东的中山地区和广西的苍梧县，发病率高达50/100000。鼻咽癌男性发病率约为女性的2-3倍，在中国南方男性中的发病率高达30.9/10万人。鼻咽癌的发生一般认为主要与遗传因素、环境因素和eb病毒(epstein-barr virus,ebv)感染等密切相关。现已证实ebv感染是鼻咽癌发生的重要原因之一。

2、eb病毒(epstein-barr virus,ebv)是epstein和barr在1964年首先从非洲儿童淋巴瘤(burkitt淋巴瘤)的活检组织中发现的一种dna病毒颗粒，属于γ病毒亚科，ebv基因组长约172kb,编码约85个基因，ebv具有疱疹病毒潜伏感染的特点，在潜伏期和裂解期表达不同的病毒基因和蛋白。ebv潜伏期表达的基因主要包括6个核抗原(ebv nuclear antigens，ebnas)，即ebna1、ebna2、ebna3a、ebna3b、ebna3c和bna-lp，2个ebv编码小rna(ebv-encodedsmall rnas，ebers)，即eber1和eber2，3个潜伏膜蛋白(latent membrane proteins，lmps)，即lmp1、lmp2a和lmp2b，bamhi-a向右开放读码框的转录产物(bamhi-a rightwardtranscripts，barts)以及微小rnas(micro rnas，包括mir-bhrf1和mir-bart)。在裂解性感染时，大量的病毒结构基因和调节基因表达，包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因。

3、eb病毒在世界范围内广泛存在，90％的成年人携带ebv。ebv感染多为无症状感染，但部分人群可发生良性或恶性疾病。eb病毒除了可引发鼻咽癌之外，还与多种肿瘤的发生有关，如burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、nk/t细胞淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增生性疾病等，总的来说，ebv与1.5％的人类癌症有关。鼻咽癌是所有ebv相关肿瘤中与ebv关系最为密切的肿瘤，病毒学检测显示所有鼻咽癌细胞中均可检测到ebv dna和ebv编码物质。

4、当前，鼻咽癌的诊断以鼻腔镜的检测为主，但由于操作烦琐、价格昂贵，不便于鼻咽癌检测的普及。以放射治疗为主的综合治疗是治疗鼻咽癌的主要方式，随着该疗法的广泛应用，鼻咽癌患者的5年生存率达80％以上，因此临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。

5、血浆ebv dna检测是继ebv抗体检测之后最后关注的指标，已经获得了广泛的认可。在鼻咽癌治疗中检测血浆eb dna的原理是由于鼻咽癌肿瘤细胞在凋亡的过程中会释放eb v dna。这些由npc释放的ebv dna片段与病毒裂解阶段释放片段相比具有更短小的特点(少于181bp)，这使得它们可以通过聚合酶链式反应(pcr)的方法进行分析和定量。

6、血浆中ebv dna检测不但在鼻咽癌的诊断和筛查中表现出较高的应用价值，事实上，目前已经应用于鼻咽癌管理的整个流程，包括与tnm分期做为参考进行治疗方的制定，治疗过程的监测，治疗之后预测预后，治疗后是否辅助化疗方案的制定等。

7、实时荧光定量pcr方法是目前血浆ebv dna检测应用最普遍的方法。常规临床应用中使用实时荧光定量pcr方法检测血浆ebv dna会受到检测阈值的限制，导致即使同一样本在不同实验室中，检测的ebv dna水平存在显著的实验室间差异。且对于低拷贝靶标的样本，荧光定量pcr检测方法的灵敏度和精确度不足，不利于进行鼻咽癌早期筛查以及治疗后的监测和预后。因此有必要研制出灵敏度更高、更精确的血浆ebv dna定量监测试剂盒，以提高ebv dna检测临床应用的可靠性。

8、数字pcr是近年来出现的较为先进的方法，液滴芯片式数字pcr平台采用绝对定量的方式，不依赖标准曲线和定量参考品，直接检测目标序列的拷贝数，它的原理是将一个标准pcr反应通过芯片分配到大量微小的油包水液滴当中，每个液滴种包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(dna模板)，实现“单分子模板pcr扩增，”在芯片中进行pcr扩增后，通过拍照对液滴方式来检测液滴的荧光强度，最后通过阳性液滴的比例计算出目标核酸分子的绝对拷贝数。因此，使用该方法进行ebv dna检测和定量，有望提高检测的灵敏度和准确度。

9、目前临床上检测ebv-dna主要是结合实时荧光定量pcr技术和taqman技术，根据eb病毒基因组保守区域设计特异引物及taqman探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段dna模板发生特异性结合，在pcr延伸过程中，taq酶的外切酶活性将探针5′段荧光基团切下来，使之游离在体系中，脱离3′段淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，可供相应荧光仪器检测，从而实现对eb病毒核酸的检测。在实时荧光定量pcr技术中，引物探针组合是决定检测灵敏度和特异性的关键因素。

10、目前国内外已有多款基于实时荧光定量pcr技术检测eb病毒的试剂盒，但是这些试剂盒检测灵敏度相对偏低，不利于临床应用中该病毒引发的疾病中的肿瘤早筛和预后治疗。因此提高eb病毒检测的灵敏度，在eb病毒感染疾病的诊断及临床应用中尤为重要。

技术实现思路

1、根据第一方面，在一实施例中，提供一种引物组合，所述引物组合用于检测eb病毒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含seq id no:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含seqid no:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含seq id no:9所示核苷酸序列所构成的组。

2、根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包括第一方面任意一项所述的引物组合。

3、根据第三方面，在一实施例中，提供第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种在制备检测试剂中的用途；所述第一目标序列包含seq id no:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含seq id no:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含seq id no:9所示核苷酸序列所构成的组。

4、在一实施例中，本发明提供的引物可以明显提高临床检测eb病毒的灵敏度，特别是针对早期样本的检测具有较高准确性。

技术特征：

1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合用于检测eb病毒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含seqidno:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含seq id no:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含seq id no:9所示核苷酸序列所构成的组。

2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合中的至少一种；

3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合中的至少两种。

4.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合中的全部。

5.一种试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1～4任意一项所述的引物组合。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含探针。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述探针包含seq id no:4、8、12所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。

8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，任一所述探针的一端修饰有荧光基团，另一端修饰有淬灭基团。

9.第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种在制备检测试剂中的用途；所述第一目标序列包含seq id no:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含seq id no:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含seq id no:9所示核苷酸序列所构成的组。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述检测试剂用于检测eb病毒。

技术总结
一种用于检测EB病毒的引物组合及其试剂盒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列所构成的组。发明提供的引物可以明显提高临床检测EB病毒的灵敏度，特别是针对早期样本的检测具有较高准确性。

技术研发人员：任浩凡,温碧霞,卢丹,吴天准
受保护的技术使用者：深圳市中科先见医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14