一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法与流程

本发明属于生物医药，特别是涉及一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法。

背景技术：

1、细胞治疗，是目前靶向治疗癌症的重要研究方向。在细胞治疗领域，用慢病毒转染t细胞，以实现外源基因的导入是常用的构建慢病毒载体的技术手段。t细胞转导率是最终产品质量把控的重要指标。转导率过低时，会导致病人体内存在大量无关细胞；此外，为保证外源基因的导入量，转导率低则需要使用大量的病毒，从而直接提高细胞治疗的生产成本；与此同时，为了达到所需的剂量，低转导率还会导致细胞培养的时间增长，而长时间的培养则会导致t细胞的分化，进而降低临床疗效。由此可见，提高病毒的转导率是提升细胞治疗效率的关键性问题。

2、目前，现有技术中，提高细胞转导率主要有两个方向，一是在病毒载体本身层面进行研究，比如尝试不同的启动子、优化基因序列等；二是在病毒感染细胞的方法层面进行研究，如添加如鱼精蛋白、聚凝胺polybrene等促进转导的试剂，或者采用离心转导的方式来提高转导效率。然而，对于病毒载体本身的优化，具有一定的局限性和不确定性；二添加促转导试剂，则需要促转导试剂在药用辅料的级别上产生明显的促转导效率，聚凝胺polybrene并非药用辅料，而鱼精蛋白的促转导效率有限，仅能在原有基础上提高20％-50％；此外，离心转导的方式则需在专门设备的基础上进行，既增加了工艺的复杂性，还提高了生产成本，对于放大生产中转导率的提高是有限的。

3、因此，基于以上现有检测方法的局限性，本领域亟需一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，在不增加工艺复杂性且兼顾生产成本的基础上，能够大幅提高慢病毒转导t细胞的效率。

技术实现思路

1、铂乐沙姆p338通过亲水性区域偶联目的物质，即慢病毒，疏水性区域降低细胞膜的微粘度，来提高磷脂的交换，增强细胞膜对离子和溶液的运输，从而达到促进慢病毒lvv转导的作用。然而，单纯的铂乐沙姆p338等促转导剂的添加，对慢病毒lvv的转导率的提升是有限的，目前主流的培养条件下，采用培养瓶或透气袋进行静态培养，病毒的转导率为10％，添加了铂乐沙姆p338等促转导剂后，一般可提升至30％，仍处于较低的水平。

2、为解决以上技术问题，本发明提供了一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，包括如下步骤：

3、步骤1、慢病毒载体的构建：采用四质粒系统，采用293细胞进行转染包装，得到构建好的慢病毒载体；

4、步骤2、外周血单核细胞的获取和前处理：从人外周血中分离获得待转导的外周血单核细胞，激活后，接种至培养基中进行培养，所述外周血单核细胞包括t细胞、nk细胞、b细胞和单核细胞；

5、步骤3、联合转导：向步骤2中获取并处理完成的外周血单核细胞中加入步骤1中构建好的慢病毒载体，进行病毒转导，所述联合转导是指添加促转导剂的同时，对细胞进行动态培养，所述动态培养为水平摇床摇晃培养或搅拌培养。

6、具体地，步骤1中，所述四质粒系统包括gag-pol包装质粒、rev包装质粒、包膜质粒和转移质粒。

7、具体地，步骤2中，所述培养基为optmizer培养基、texmacs培养基、x vivo培养基、optivitro培养基和nutri t培养基中的一种。

8、具体地，步骤2中，所述培养的条件为37℃，co2浓度为5％。

9、具体地，步骤2中，所述培养的时间为36-48h。

10、优选地，步骤2中，所述培养的时间为36h或48h。

11、具体地，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338、鱼精蛋白protamine、聚凝胺polybrene、letiboost和vfusion中的一种。

12、优选地，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338。

13、具体地，步骤3中，所述促转导剂的浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。

14、优选地，步骤3中，所述促转导剂的浓度为1.0mg/ml。

15、具体地，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。

16、优选地，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速100rpm，培养时间7天。

17、具体地，步骤3中，所述搅拌培养是指使用先使用搅拌桨混匀，再进行水平摇床摇晃培养，所述搅拌桨的转速为50-150rpm，所述搅拌的时间为6h。

18、具体地，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。

19、优选地，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速100rpm，培养时间7天。

20、与现有技术相比，本发明的有益效果为：

21、1)本发明提供的方法，通过动态培养的方式，克服了静态培养下病毒仅能够在自身600微米范围内做布朗运动，而无法接触600微米以外细胞的弊端，增加了病毒和细胞的接触面积和频次，解决了病毒的浪费和转导的低效率问题。

22、2)本发明提供的方法，通过联合转导的方式，将促转导剂和动态培养的方式联合，并探索出最适宜的转导培养方法，使得动态培养的转导率进一步提升，且动态培养也进一步提升了促转导剂对磷脂交换的提高作用，二者相辅相成，共同促进了慢病毒转导外周血单核细胞的效率。

23、3)本发明提供的方法，操作简便，成本可控，可将主流培养条件下10％-30％的转导率提升至70％左右，最多可产生7倍的转导率提升效果，节省了病毒用量，降低细胞治疗的成本。

技术特征：

1.一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤1中，所述四质粒系统包括gag-pol包装质粒、rev包装质粒、包膜质粒和转移质粒。

3.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养基为optmizer培养基、texmacs培养基、x vivo培养基、optivitro培养基和nutri t培养基中的一种。

4.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的条件为37℃，co2浓度为5％。

5.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤2中，所述培养的时间为36-48h。

6.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述促转导剂为铂乐沙姆p338、鱼精蛋白protamine、聚凝胺polybrene、letiboost和vfusion中的一种。

7.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述促转导剂的浓度为0.5mg/ml-2mg/ml。

8.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述水平摇床摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。

9.根据权利要求1所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，步骤3中，所述搅拌培养是指使用先使用搅拌桨混匀，再进行水平摇床摇晃培养，所述搅拌桨的转速为50-150rpm，所述搅拌的时间为6h。

10.根据权利要求9所述的提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，其特征在于，所述摇晃培养的条件为振幅25毫米，转速50-150rpm，培养时间3-10天。

技术总结
本发明公开了一种提高慢病毒转导外周血单核细胞效率的方法，通过动态培养和促转导剂的联合转导方式，克服了静态培养下病毒仅能够在自身600微米范围内做布朗运动，而无法接触600微米以外细胞的弊端，增加了病毒和细胞的接触面积和频次，解决了病毒的浪费和转导的低效率问题，通过探索最适宜的转导培养方法，使得动态培养的转导率进一步提升，同时，本方法操作简便，成本可控，可将主流培养条件下10％‑30％的转导率提升至70％左右，对于病毒转导效率提升，节省病毒用量，降低细胞治疗成本具有重要的意义。

技术研发人员：颜海波,陈飞
受保护的技术使用者：无锡生基医药科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15